Навигатор по геному

Ученые Центрального университета предложили вычислительный метод, способный за считаные часы сужать круг поиска генов-кандидатов, которые клетки рака толстой кишки потенциально используют для своего роста.

Исследование опубликовано в Международном журнале молекулярных наук (International Journal of Molecular Sciences). Оно может стать важным шагом к созданию более эффективных лекарств от колоректального рака — одной из ключевых причин онкологической смертности в мире, и решить одну из главных проблем онкологии — устойчивости опухоли к терапии.

По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире выявляется более 1,9 млн новых случаев рака толстой и прямой кишки, а число смертей превышает 900 тыс.— это второе место среди онкологических причин смертности.

Несмотря на прогресс в ранней диагностике и лечении, проблема устойчивости опухолей к терапии остается острой: многие пациенты перестают реагировать на известные препараты, что заставляет искать новые, более точные мишени для лекарств. Одной из таких мишеней может стать особая молекула — длинная некодирующая РНК под названием SNHG1, уровень которой связан с активностью генов, важных для роста опухоли. Но до сих пор установить, на какие именно участки генома она влияет, было чрезвычайно сложно.

Российские исследователи предложили алгоритм, который помогает быстро находить новые перспективные участки генома, связанные с опухолеобразованием и пригодные для дальнейшей экспериментальной проверки в качестве потенциальных мишеней для терапии. Новый метод объединяет три независимых типа биологических данных, описывающих происхождение и природу опухоли: физические контакты между длинной некодирующей РНК и ДНК, метки активности генов и расположение так называемых суперэнхансеров — мощных активаторов, способных многократно усилить работу гена. Анализируя все три сигнала одновременно, предложенный алгоритм выделяет те участки генома, где SNHG1 с наибольшей вероятностью влияет на регуляцию генов в раковой клетке. Такие участки — первоочередные кандидаты для поиска новых мишеней терапии.

Применив алгоритм к данным клеток колоректального рака, ученые получили короткий список из 12 перспективных генов-мишеней вместо тысяч возможных вариантов. Активность всех этих генов повышена в опухолях пациентов по сравнению со здоровой тканью и связана с уровнем SNHG1. Уровень этой длинной некодирующей РНК в опухолевых тканях оказался более чем втрое выше, чем в здоровых, что подтверждено анализом данных свыше 500 образцов. Авторы подчеркивают, что результаты получены вычислительными методами и требуют экспериментального подтверждения.

Особенно примечательно, что среди найденных генов есть мишени для уже применяемых препаратов — например, ген TOP1, белок которого служит мишенью иринотекана, одного из основных химиопрепаратов при колоректальном раке,— что подтверждает точность предлагаемого российскими учеными нового подхода. Это открывает возможности для дальнейших исследований. В перспективе такой подход может помочь точнее подбирать терапию — оценивать, кому из пациентов с большей вероятностью подойдет стандартное лечение, а кому стоит подбирать альтернативы.

Герман Ашниев, научный сотрудник лаборатории вычислительной биомедицины и молекулярной диагностики Центрального университета, рассказал в интервью «Ъ-Науке» о новом алгоритме, который за часы сокращает поиск генов-мишеней при колоректальном раке с тысяч до дюжины.

— Причин несколько. Прежде всего поздняя диагностика: значительная часть опухолей выявляется, когда уже есть метастазы, а скрининг охватывает далеко не всех. Вторая причина — в биологической неоднородности: опухоль представляет собой не однородную массу клеток, а смесь групп клеток с разными свойствами. Отсюда и устойчивость. Препарат уничтожает чувствительные клетки, но те, которые по каким-то причинам к нему невосприимчивы, выживают и дают начало новой популяции, уже нечувствительной к лечению. Причем устойчивость не всегда связана с мутациями в ДНК: клетка способна изменить активность генов, не меняя их последовательности, за счет эпигенетической регуляции. В опухолях этот регуляторный слой существенно перестроен: появляются, например, суперэнхансеры — регуляторные участки, которых нет в здоровой ткани и которые поддерживают работу нужных опухоли генов.

Именно этому регуляторному слою и была посвящена наша исследовательская работа. Задача в том, чтобы находить в геноме точки, через которые опухоль управляет собственными генами. Пока эти точки не найдены, вмешиваться некуда.

— SNHG1 расположена на 11-й хромосоме. Формально это ген-«контейнер» для восьми малых ядрышковых РНК, но сама эта РНК работает как самостоятельный регулятор. Белок она не кодирует: ее роль управляющая.

Сама по себе повышенная концентрация SNHG1 значит немного: повышенный уровень чего-либо в опухоли — наблюдение распространенное, но важнее комбинация свойств. Около 70% SNHG1 находится преимущественно в ядре, то есть там же, где ДНК. Она физически контактирует с хроматином в тысячах точек по всем хромосомам — мы получили 17 027 достоверных участков контакта. Причем повышение воспроизводится: по данным TCGA (471 опухоль против 41 образца нормальной ткани), уровень SNHG1 в опухоли выше примерно в 3,6 раза при очень высокой статистической значимости.

Отдельную роль сыграла доступность данных. Наш подход требует, чтобы для одной и той же молекулы существовали сразу три типа измерений. Для SNHG1 такие данные есть именно в линии колоректального рака — сочетание нечастое. Поэтому в нашей работе SNHG1 служит точкой входа: мы используем ее как зонд, чтобы найти участки генома, которые могут стать мишенями.

— Основная сложность в том, что ни один из доступных типов данных сам по себе ответа не дает. По сути, соприкосновение РНК с ДНК еще не значит, что она управляет работой генов в этом месте. У SNHG1 таких контактов больше 17 тыс., и большая часть, вероятно, функционального значения не имеет. Мы это проверили напрямую: контакты SNHG1 обогащены не только на суперэнхансерах, но и на обычных энхансерах, причем примерно в одинаковой степени. То есть по одним контактам суперэнхансеры не выделяются.

Второй признак — изменение в этом месте эпигенетических меток вместе с уровнем SNHG1, но его тоже недостаточно. Мы проверили через ту же процедуру все 4145 длинных некодирующих РНК, каталогизированных в базе: по одному этому признаку SNHG1 попадает в верхние 7% (93-й процентиль), но 162 другие РНК показывают такое же или большее перекрытие с суперэнхансерами. То есть выделить SNHG1 по корреляциям нельзя.

Раньше задачу решали экспериментально и поштучно: подавляли работу конкретной РНК и смотрели, активность каких генов изменилась. Подход рабочий, но он дает смесь прямых и косвенных эффектов и требует месяцев работы на каждую гипотезу.

— Мы предложили алгоритм, который сводит вместе три независимых слоя данных о работе генома, каждый из которых по отдельности уже существовал в открытом доступе.

Первый слой — контакты РНК с хроматином, то есть места, где молекула физически садится на ДНК. После обработки мы получили 17 027 достоверных участков контакта.

Второй слой — корреляции с гистоновыми метками. Это участки генома, где интенсивность эпигенетических модификаций закономерно меняется вместе с уровнем SNHG1 в разных клетках и тканях. Для SNHG1 таких участков 90 586.

Третий слой — разметка суперэнхансеров. Мы собрали консенсусную карту из 571 суперэнхансера, из которых 184 характерны для опухолевой линии и отсутствуют в нормальной ткани кишечника.

Пересечение первых двух слоев дает 2640 участков, где SNHG1 и физически присутствует, и связана с локальным эпигенетическим состоянием. Наложение этих участков на 184 опухолевых суперэнхансера оставляет 21 суперэнхансер. Мы назвали их -суперэнхансерами, реактивными к SNHG1, а остальные 163 суперэнхансера, независимых от нее, обозначили как . Принципиально здесь именно пересечение: по отдельности ни один слой SNHG1 не выделяет — по каждому признаку в одиночку она не отличается от сотен других похожих РНК.

— «Часы» здесь означают время расчета. Вся тяжелая экспериментальная работа уже проделана и лежит в открытых базах данных, а наш вклад в том, как эти данные сопоставить.

Список сужается так: на входе 90 586 участков с эпигенетическими корреляциями и 17 027 участков физического контакта. Их пересечение оставляет 2640 участков, а из 184 опухолевых суперэнхансеров эти участки попадают в 21. У 17 из них в радиусе 100 тыс. пар оснований есть работающие белок-кодирующие гены, что дает 66 пар «суперэнхансер—ген». Дальше тройной фильтр: ген должен быть активнее в опухолевой линии, активнее в опухолях пациентов по сравнению с прилежащей нормальной тканью и положительно коррелировать с уровнем SNHG1 на выборке из 471 опухоли. Все три условия выдержали 12 генов из семи суперэнхансеров.

Технически это операции пересечения геномных интервалов, проверка на случайность методом перестановок (тысяча итераций) и корреляционный анализ. Таким образом, алгоритм работает как навигатор: он не дает готового ответа, но сокращает перебор от тысяч вариантов до короткого списка с координатами, и на это уходят часы вместо месяцев.

— Это независимая проверка на осмысленность, то, что в науке называют положительным контролем.

Алгоритм ничего не знал ни о функциях генов, ни тем более о лекарствах, он работал только с геномными координатами. И на выходе из 12 генов четыре оказались с уже известной ролью в колоректальном раке: CDC20 как прогностический фактор, TOP1 как мишень иринотекана, TXNRD1 как мишень ауранофина, PDP1 как участник сигнального каскада при KRAS-мутантных опухолях. Если бы алгоритм выдавал случайный набор, такого совпадения ожидать не приходилось бы.

Отсюда следует, что воронка обогащена биологически осмысленными генами и приводит туда, куда онкология пришла своим путем. Вопрос о том, регулирует ли SNHG1 именно TOP1, остается открытым: ген TOP1 жизненно важный и высокоэкспрессированный, его повышение в опухолях известно давно и может объясняться другими причинами. Показательно другое: ни один из этих 12 генов ранее не описывался как регуляторная мишень SNHG1, то есть все 12 — новые кандидаты, и каждый предстоит проверить.

— Требуют, и мы прямо пишем об этом в статье. Результат корреляционный. Мы показываем, что физический контакт SNHG1 с хроматином и изменение эпигенетических меток встречаются в одних и тех же точках вдвое чаще, чем можно ожидать случайно. Совместная встречаемость еще не означает причинно-следственной связи.

Мы дали лабораториям инструмент и проверяемую гипотезу с конкретными координатами. Дальше — экспериментальная проверка, чтобы установить причинность: подавить SNHG1 в клетках и посмотреть методами ChIP-seq или CUT&Tag, изменятся ли гистоновые метки в этих 21 участках и изменится ли работа генов-кандидатов.

Есть и другие ограничения, которые мы перечисляем открыто. Работа выполнена на одной клеточной линии. Корреляции взяты из сравнения разных типов клеток. Гены к суперэнхансерам мы привязывали по расстоянию, до 100 тыс. пар оснований, а часть регуляторных связей заведомо дальнодействующие: для четырех участков подходящих генов поблизости не нашлось, и их предстоит искать по данным о пространственной укладке генома.

Гипотезу мы формулировали так, чтобы ее можно было проверить,— с координатами и списком генов. В этом и состояла задача.

— Это перспектива, а не сегодняшняя практика, но путь к ней просматривается вполне конкретный. TOP1 служит мишенью иринотекана, одного из основных препаратов при колоректальном раке, и его уровень давно обсуждается как кандидатный маркер ответа на лечение. Если экспериментальные лаборатории подтвердят, что уровень TOP1 связан с уровнем SNHG1, то появится возможность использовать один показатель как косвенный признак другого.

Между этой возможностью и решением у постели больного лежит несколько отдельных исследований: связь нужно подтвердить экспериментально, TOP1 предстоит валидировать как предиктивный маркер, пока он остается кандидатом, и все это проверить в проспективном клиническом исследовании.

Здесь важен масштаб, на котором получены наши цифры. Корреляции измерены на сотнях опухолей и описывают тенденцию в популяции, а решения принимаются по отдельному пациенту. Это разные уровни, и переход между ними составляет самостоятельную задачу.

— По устройству алгоритм универсален для изучения других типов рака по мере накопления данных. Классификация на и не содержит ничего специфичного ни для SNHG1, ни для колоректального рака: ее можно применить к любой длинной некодирующей РНК и к любому типу клеток, для которых есть все три типа данных.

Формальный резерв большой: в использованной нами базе эпигенетических корреляций каталогизировано 4145 длинных некодирующих РНК, а суперэнхансеры размечены для множества типов клеток.

Узкое место сегодня в данных о контактах РНК с хроматином. Экспериментов, где картируются контакты одной конкретной молекулы по всему геному, пока сравнительно немного, и они покрывают ограниченный набор сочетаний «РНК и тип клеток». По мере накопления таких данных метод будет применим шире.

Конкретные 21 суперэнхансер и 12 генов относятся к изученной линии колоректального рака. Для другой опухоли тот же алгоритм даст свой список.

— Называть срок сейчас преждевременно, но последовательность шагов понятна. Ближайший шаг — это экспериментальная проверка в клетках: подавление SNHG1 с последующим эпигенетическим профилированием и анализом экспрессии генов-кандидатов, а также данные о пространственной укладке генома, чтобы уточнить, какие гены действительно подчиняются найденным суперэнхансерам. Дальше воспроизведение на других моделях: панели клеточных линий, органоиды пациентов, первичные опухоли. Затем, если функциональная связь подтвердится, ретроспективная проверка на архивных когортах и проспективные клинические исследования.

Замечу, что сам этот путь заметно ускорился. Вычислительный этап, прежде означавший годы перебора, теперь занимает часы, и в лабораторию поступает не общая гипотеза, а короткий список с координатами. Органоиды пациентов позволяют проверять такие гипотезы существенно быстрее прежних моделей.

Для нашего случая важно и то, что среди найденных генов есть мишени уже зарегистрированных препаратов: иринотекан применяется в клинике десятилетиями, ауранофин известен как лекарство и исследуется в новом качестве. Работа с существующим препаратом всегда короче разработки молекулы с нуля. Наша лаборатория вычислительной биомедицины и молекулярной диагностики Центрального университета продолжит двигаться в этом направлении: чем точнее карта, тем короче путь от гипотезы до проверки.