Без лаборатории

CAR-T-терапия произвела революцию в онкологии, но ее персонализированный цикл «извлечение — модификация — возврат клеток пациенту» остается узким местом с точки зрения масштабирования и коммерциализации. Команда Научного центра трансляционной медицины университета «Сириус» предлагает иной путь: липидные наночастицы с мРНК и адресными белками DARPin, которые позволяют «программировать» иммунные клетки прямо в организме.

Технологическая изюминка — направленное присоединение DARPin к поверхности наночастиц с помощью клик-химии и встраивания неприродных аминокислот, что отличает платформу от конкурирующих решений. На мышиных CD8⁺-Т-лимфоцитах in vitro уже продемонстрирована избирательная доставка мРНК и экспрессия репортерного белка; параллельно начата разработка второго адресного лиганда — Эксендина-4 — для нацеливания на β-клетки поджелудочной железы, что открывает перспективы при аутоиммунном сахарном диабете 1-го типа. Если платформа подтвердит работоспособность, в перспективе можно будет отказаться от сложных лабораторных манипуляций с клетками пациента и получить управляемый эффект, сопоставимый с CAR-T. Однако между мышиными клетками in vitro и применением у человека — иммуногенность при повторных введениях, уход от адресности в живом организме и масштабирование производства; к тому же временная экспрессия мРНК может потребовать повторного введения препарата. О реальной степени зрелости технологии и о том, сколько ей осталось до «доступного лекарства», «Ъ-Наука» поговорил со специалистом-исследователем направления «Медицинская биотехнология» Научного центра трансляционной медицины университета «Сириус» Анастасией Дахневич.

— Помимо CD8⁺-Т-лимфоцитов, платформу потенциально можно адаптировать для доставки мРНК в другие типы клеток, включая NK-клетки и макрофаги. Это открывает перспективы для развития CAR-T-, CAR-NK- и CAR-M-терапии. В частности, доставка мРНК, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), непосредственно в клетки иммунной системы может обеспечить их временное перепрограммирование для распознавания и уничтожения опухолевых клеток. Такой подход потенциально позволит отказаться от сложной процедуры извлечения клеток пациента, их генетической модификации вне организма и последующего возвращения клеток пациенту. Для этого потребуется разработать белки-лиганды, специфично связывающиеся с рецепторами соответствующих клеток, и проверить, обеспечивают ли они эффективную доставку мРНК.

Еще один белок, находящийся в разработке на данный момент, Эксендин-4 (Exendin-4), липидные наночастицы с которым будут использоваться для нацеливания на клетки, экспрессирующие рецептор GLP-1R, в частности на -клетки островков Лангерганса поджелудочной железы. Связывание лиганда с рецептором способствует рецептор-опосредованному повышению эффективности трансфекции мРНК ЛНЧ. Это направление перспективно для лечения аутоиммунного сахарного диабета 1-го типа, при котором иммунная система разрушает β-клетки поджелудочной железы. Адресная доставка мРНК в сохранившиеся -клетки потенциально позволит обеспечить экспрессию белков, способствующих их защите и сохранению секреции инсулина.

— Расширение генетического кода позволяет встраивать неприродные аминокислоты (НПА) в заданные позиции DARPin. Для этого используют специальные пары «ортогональная тРНК — аминоацил-тРНК-синтетаза»: синтетаза присоединяет НПА к тРНК, которая распознает определенный кодон мРНК и доставляет аминокислоту в растущую белковую цепь.

Две и более одинаковые НПА (например, 2 и более азидо-фенилаланина) можно встроить, используя одну систему и один кодон в разных позициях белка. Для включения двух разных НПА нужны два различимых кодона и соответствующие ортогональные системы, работающие совместно. Это усложняет синтез и требует дополнительной оптимизации.

— DARPin имеет ряд преимуществ для декорирования липидных наночастиц (ЛНЧ). Благодаря небольшому размеру он позволяет функционализировать поверхность частиц без значительного увеличения их габаритов. Высокая термическая стабильность и хорошая растворимость упрощают получение и подготовку белка. Кроме того, DARPin удобен для модификации методами белковой инженерии: в него можно вводить неприродные аминокислоты, обеспечивающие направленное и контролируемое присоединение к поверхности ЛНЧ.

Основные ограничения связаны с тем, что DARPin потенциально может вызывать иммунный ответ при введении в организм.

— Да, потенциально платформа может использоваться для доставки не только мРНК, но и других терапевтических грузов. Липидные наночастицы способны инкапсулировать нуклеиновые кислоты, включая siRNA, а также некоторые белки и лекарственные соединения. Однако успешность доставки мРНК не гарантирует аналогичной эффективности для siRNA, белков или лекарств: каждый тип груза требует отдельной оптимизации состава наночастиц и экспериментальной проверки.

— Наиболее перспективное применение адресной доставки мРНК в CD8⁺-Т-клетки — лечение рака, поскольку эти клетки способны распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Доставка мРНК непосредственно в CD8⁺-Т-лимфоциты может позволить временно программировать их — например, на экспрессию химерного антигенного рецептора (CAR) — или усиливать их противоопухолевую активность.

При хронических вирусных инфекциях — например, ВИЧ-инфекции — платформа потенциально может применяться для усиления распознавания и уничтожения инфицированных клеток. Однако вирусы способны уклоняться от иммунного ответа, а уничтожение резервуаров инфекции остается сложной задачей.

При аутоиммунных заболеваниях одним из перспективных направлений является избирательная деплеция (удаление) патологических В-лимфоцитов, которые участвуют в развитии заболевания за счет выработки аутоантител и поддержания воспалительного иммунного ответа. Для этого можно использовать мРНК, кодирующую CAR или химерные аутоантигенные рецепторы (CAAR), которые позволяют Т-клеткам распознавать В-лимфоциты, несущие рецепторы к определенному аутоантигену, и избирательно уничтожать их. Такой подход потенциально позволяет устранить именно те В-клеточные клоны, которые участвуют в аутоиммунной реакции, сохраняя большую часть нормальной популяции В-лимфоцитов. Это представляет интерес для лечения заболеваний, связанных с образованием патогенных аутоантител — например, пузырчатки и некоторых форм миастении. Адресная доставка мРНК непосредственно в Т-клетки могла бы упростить временное программирование их активности без постоянного изменения генома.

— Главное потенциальное преимущество адресной доставки мРНК непосредственно в организм (in vivo CAR-T) — возможность модифицировать собственные Т-лимфоциты пациента без их предварительного извлечения, генетической модификации и размножения в лаборатории. Это может значительно упростить и ускорить лечение, а также снизить его стоимость за счет сокращения количества индивидуальных производственных этапов. Кроме того, мРНК обеспечивает временную экспрессию CAR-рецептора, поскольку постепенно разрушается и не встраивается в геном клетки. Это позволяет ограничивать продолжительность активации Т-лимфоцитов и потенциально снижать риски длительной неконтролируемой иммунной реакции.

Однако у подхода есть ограничения: временная экспрессия CAR может потребовать повторного введения препарата, а эффективность будет зависеть от точности доставки мРНК и количества модифицированных клеток. Таким образом, технология потенциально способна сделать CAR-T-терапию более доступной, быстрой и управляемой, но ее эффективность и безопасность еще предстоит подтвердить в доклинических и клинических исследованиях.

— Да, при повторных введениях DARPin иммунная система может распознавать его как чужеродный белок и вырабатывать антитела против него (ADA, anti-drug antibodies). Это может ускорять выведение препарата из организма, снижать эффективность адресной доставки и в некоторых случаях вызывать нежелательные иммунные реакции. Однако такой ответ возникает не обязательно: он зависит от структуры DARPin, дозы, способа введения и индивидуальных особенностей пациента.

Чтобы снизить риск иммуногенности, можно использовать несколько подходов. Во-первых, оптимизировать аминокислотную последовательность DARPin, уменьшая количество потенциальных эпитопов, распознаваемых Т-лимфоцитами, при сохранении сродства к мишени. Во-вторых, оптимизировать состав наночастиц, поскольку он влияет на взаимодействие препарата с иммунными клетками. Также важно учитывать, что присоединение неприродных аминокислот или химических групп само по себе может создавать новые потенциальные эпитопы.

Полностью исключить иммунный ответ невозможно, но его вероятность можно снизить посредством белковой инженерии и оптимизации состава препарата.

— Адресность, показанная на мышиных клетках in vitro, не гарантирует сохранения такой же эффективности in vivo. В организме на работу платформы влияют дополнительные факторы: распределение наночастиц между органами, их взаимодействие с белками крови, захват клетками печени и селезенки, а также доступность рецепторов на поверхности клеток-мишеней.

Отдельная проблема — корона из белков плазмы, которая образуется на поверхности наночастиц и может маскировать адресный DARPin, снижая его способность связываться с нужными клетками. Также возможны преждевременное разрушение частиц, недостаточное проникновение в ткань и захват макрофагами.

Поэтому вероятность сохранения адресности нельзя надежно оценить без дополнительных экспериментов. Для проверки уже проводятся испытания на мышах in vivo, сравнивая адресные частицы с неадресными контрольными образцами.

— Да, теоретически созданную в рамках данного исследования платформу можно использовать не только для вооружения CD8⁺-Т-лимфоцитов, но и для временного подавления их активности. Нужно выбрать правильную мРНК, которую хотим доставить при помощи данного метода. Для супрессии в клетки доставляют мРНК, кодирующую белки, которые тормозят иммунный ответ или изменяют функциональное состояние Т-клеток.

Отдельный интерес представляет возможность воздействия на регуляторные Т-клетки (Treg), которые естественным образом подавляют избыточные иммунные реакции и поддерживают иммунологическую толерантность. Доставка мРНК в эти клетки потенциально позволит усилить их супрессивную функцию, например, за счет экспрессии регуляторных молекул. Такой подход может быть перспективен при аутоиммунных заболеваниях и отторжении трансплантата, поскольку позволит ограничивать патологическую активность иммунной системы. Однако для этого потребуется разработать отдельные адресные лиганды, обеспечивающие избирательную доставку именно в Treg-клетки.

При аутоиммунных заболеваниях такой подход мог бы уменьшать повреждение собственных тканей, а при трансплантации — снижать вероятность иммунного отторжения органа. Однако подавление только CD8⁺-Т-клеток не всегда достаточно: в отторжении трансплантата и аутоиммунных реакциях участвуют также другие популяции иммунных клеток.

Главное преимущество подхода — таргетная доставка со строго специфично расположенными белковыми молекулами на поверхности ЛНЧ, другой вопрос — что доставляют эти ЛНЧ.

— Чтобы технологическая платформа превратилась в готовое лекарство, необходимо пройти доклинические и клинические этапы разработки. При этом значительная часть технологической работы уже выполнена в рамках исследования.

В рамках исследования получены и охарактеризованы липидные наночастицы, разработан метод синтеза DARPin с включением неприродной аминокислоты, отработано его направленное присоединение к поверхности ЛНЧ с помощью клик-химии. На мышиных CD8⁺-Т-лимфоцитах in vitro продемонстрирована избирательная доставка мРНК и экспрессия репортерного белка. Также начата разработка дополнительного адресного лиганда — Эксендина-4 — для нацеливания на β-клетки поджелудочной железы.

Предстоящие этапы включают оптимизацию плотности адресных белков на поверхности наночастиц, оценку воспроизводимости производства и стабильности препарата. Далее необходимо провести исследования in vivo на животных, чтобы оценить распределение наночастиц, эффективность доставки мРНК в клетки-мишени, токсичность и иммуногенность.

Таким образом, сейчас основная задача — перейти от доказательства работоспособности технологии в пробирке к подтверждению ее эффективности и безопасности в живом организме.