Нацелен на митохондрии

Исследовательская группа научно-технологического университета «Сириус» представила усовершенствованный подход к генной терапии наследственной оптической нейропатии Лебера (LHON) — тяжелого митохондриального заболевания, которое приводит к быстрой и зачастую необратимой потере центрального зрения. Работа посвящена оптимизации доставки терапевтического гена, кодирующего белок ND4 в митохондрии клеток, что может существенно повысить эффективность будущих методов лечения одной из наиболее распространенных форм наследственной слепоты. Результаты исследования опубликованы в международном научном журнале Frontiers in Bioengineering and Biotechnology.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

Наследственная оптическая нейропатия Лебера чаще всего вызывается мутацией mt.11778G>A в митохондриальном гене MT-ND4, нарушающей работу первого комплекса дыхательной цепи митохондрий. Из-за этого клетки сетчатки, особенно ганглиозные клетки зрительного нерва, испытывают тяжелый энергетический дефицит, страдают от избыточного окислительного стресса и нарушений кальциевого обмена, что в конечном итоге приводит к их гибели.

Поскольку митохондриальная ДНК крайне сложно поддается прямому редактированию, одним из наиболее перспективных подходов считается аллотопическая экспрессия — перенос рабочей копии поврежденного митохондриального гена в ядро клетки с последующей доставкой синтезированного белка обратно в митохондрии.

В новом исследовании ученые Научного центра трансляционной медицины научно-технологического университета «Сириус» протестировали пять различных митохондриальных сигнальных последовательностей (MTS), отвечающих за транспорт терапевтического белка ND4 к месту его действия. Наиболее эффективной оказалась последовательность MTS-cox8k. Использование именно этой конструкции в клеточной модели позволило существенно восстановить митохондриальную функцию: уровень активных форм кислорода снизился на 72%, содержание кальция в митохондриях уменьшилось на 47%, а митохондриальный мембранный потенциал увеличился на 38%. Эти результаты свидетельствуют о выраженном снижении клеточного стресса и частичном восстановлении энергетического обмена.

Исследование показало, что выбор транспортной последовательности играет критически важную роль в успехе терапии. Универсального решения для доставки митохондриальных белков не существует: эффективность напрямую зависит от структуры конкретного белка, поэтому для каждого заболевания может потребоваться отдельная оптимизация.

Для проведения работы была создана специализированная клеточная модель на основе линии HEK-293 с митохондриями пациентов, несущих мутацию mt.11778G>A. Хотя эта система не полностью воспроизводит патологию ганглиозных клеток сетчатки, она представляет собой важную биотехнологическую платформу для первичного тестирования терапевтических конструкций и последующего контроля качества будущих препаратов.

Следующим этапом исследований станут испытания на нейрональных моделях, включая ганглиозные клетки сетчатки, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов, а также доклинические исследования на животных моделях с оценкой безопасности и эффективности вирусной доставки.

Несмотря на то что технология пока находится на доклинической стадии, работа уже рассматривается как важный шаг к созданию следующего поколения генной терапии наследственной нейропатии Лебера. Поскольку исследование направлено на оптимизацию уже существующего терапевтического подхода, а не создание принципиально новой платформы, переход к практическому применению потенциально может быть ускорен.

Разработка эффективной терапии имеет особую значимость, поскольку существующие методы лечения, включая идебенон, способны лишь частично замедлить прогрессирование болезни, но редко позволяют восстановить утраченное зрение. Новая стратегия приближает создание патогенетического лечения, способного воздействовать непосредственно на молекулярную причину заболевания, что может существенно изменить перспективы для пациентов с наследственной митохондриальной слепотой. Исследование реализуется в рамках масштабного проекта «Разработка генотерапевтических продуктов для лечения наследственных ретинопатий и нейропатий» научной группы направления «Генная терапия» под руководством Александра Карабельского.

Евгений Лапшин, младший научный сотрудник направления «Генная терапия» Научного центра трансляционной медицины, выпускник магистерской программы «Генетика и генетические технологии» научно-технологического университета «Сириус», ответил на вопросы «Ъ-Наука».

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

— Что такое наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) и почему эта форма наследственной слепоты считается одной из самых трудноизлечимых? Какая мутация становится причиной и как она приводит к гибели клеток сетчатки?

— Наследственная оптическая нейропатия Лебера (LHON) — это заболевание, характеризующееся потерей центрального зрения вследствие дегенерации ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и их аксонов, формирующих зрительный нерв. LHON считается одной из самых трудноизлечимых форм наследственной слепоты по причине митохондриальной природы мутации. В отличие от ядерных заболеваний мутация находится в митохондриальной ДНК, которую сложно редактировать. Заболевание проявляется в возрасте от 15 до 35 лет, где сначала страдает один глаз, а через несколько недель или месяцев второй.

Основная причина — мутация mt.11778G>A в гене MT-ND4, который кодирует субъединицу 4 NADH-дегидрогеназы (ND4), участник комплекса I дыхательной цепи. Эта мутация заменяет аргинин на гистидин в положении 340 (R340H), что нарушает поток электронов в комплексе I, снижается эффективность окислительного фосфорилирования. Падает синтез АТФ, возникает избыточная генерация активных форм кислорода, нарушается кальциевый гомеостаз. Ганглиозные клетки сетчатки, имеющие высокую энергетическую потребность и длинные аксоны, погибают. Развивается атрофия зрительного нерва и необратимая потеря центрального зрения.

—Почему митохондриальную ДНК так сложно редактировать напрямую? Что заставило ученых искать обходной путь — аллотопическую экспрессию? В чем заключается предложенный вами подход? Как удалось перенести рабочую копию гена ND4 из митохондрий в ядро клетки и затем вернуть белок обратно по назначению?

—Прямое редактирование митохондриальной ДНК затруднено двойной мембраной органеллы, и доставить туда инструменты редактирования сложнее, чем в ядро. В одной клетке могут находиться сотни митохондрий, в каждой — несколько копий ДНК. Чтобы исправить фенотип, нужно отредактировать практически все мутантные копии, а это технически нереалистично. Именно эти препятствия вынуждают создать рабочую копию целевого гена вне митохондрий. Аллотопическая экспрессия относится к экспрессии генов в ядре клетки, которые обычно экспрессируются только из митохондриального генома.

Мы создали генетическую конструкцию, которая оптимизирована для синтеза белковой субъединицы ND4 (назвали ее ND4opt) вне митохондрии. К началу гена ND4opt мы присоединили последовательность, кодирующую митохондриальный сигнал транслокации (MTS). Это короткий пептид, который направляет белки из цитоплазмы в митохондрии. Мы протестировали пять разных MTS и нашли самый эффективный — MTS-cox8k. В итоге функционально активный белок ND4 оказывается во внутренней мембране митохондрий, где и должен работать в составе комплекса I дыхательной цепи.

— Вы протестировали пять разных митохондриальных сигнальных последовательностей (MTS). Почему выбор «транспортного адреса» оказался критически важен? И почему не существует универсального решения для всех белков?

— Выбор MTS обусловлен тем, что недостаточно доставить ген в ядро и даже синтезировать белок, нужно, чтобы белок оказался именно в том компартменте митохондрий, где он работает, и в нужной конформации. Мы тестировали пять разных MTS, присоединенных к ND4. Результаты оказались различными. Выяснилось, что некоторые MTS не просто бесполезны, они могут быть вредны. Взаимодействие MTS со структурой самого транспортируемого белка имеет значение. MTS находится на N-конце, но дальнейшее свойство белка зависит от того, как этот N-концевой хвост взаимодействует с последующими частями. Подходящий MTS для одного белка может не оказаться таким для другого из-за разных локальных, зарядов и гидрофобности на стыке.

— Какая последовательность показала наилучший результат (MTS-cox8k) и какие цифры подтверждают ее эффективность? Что означают показатели снижения активных форм кислорода на 72%, уменьшения кальция на 47% и роста мембранного потенциала на 38%?

— Наилучший результат показала последовательность MTS цитохромоксидазы 8 (MTS-cox8k), вариант без замены лизина на аспарагин. Именно этот MTS, присоединенный к N-концу белка ND4, обеспечил наибольшую коррекцию митохондриальной функции в нашей модели HEK-293 (LHON) в отношении снижения уровней активных форм кислорода на 72%, митохондриального кальция на 47% и роста мембранного потенциала митохондрий на 38%.

При дефектах комплекса I ЭТЦ электроны переходят на кислород и образуют опасные активные формы кислорода (АФК), которые повреждают липиды, белки и ДНК. Снижение АФК показывает, что доставленный белок ND4 действительно восстановил нормальный поток электронов и остановил утечку электронов.

В норме митохондрии поглощают Ca как буфер, но при повреждении комплекса I мембранный потенциал падает, кальций накапливается до токсичных уровней. Снижение уровня митохондриального кальция — признак того, что опасная перегрузка ушла, а кальциевые транспортеры работают правильно.

Мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) создается комплексом I, III и IV за счет выкачивания протонов в межмембранное пространство. Это напряжение движет синтез АТФ. Рост m означает, что комплекс I с нашей рабочей копией ND4 снова может переносить протоны и клетка получает больше энергии.

— Какую клеточную модель вы создали для тестирования? Почему для первичных экспериментов подошла линия HEK-293 с митохондриями пациентов и какие у этой модели есть ограничения?

— Мы создали линию HEK-293-LHON, несущую мутацию mt.11778G>A в гене MT-ND4. Для этого мы сначала лишили исходные HEK-293 их собственных митохондрий, длительно культивируя клетки с бромистым этидием (EtBr), уридином и пируватом, так получили линию HEK-293 Rho0 (клетки без митохондрий). Затем ввели в них митохондрии от пациента с болезнью Лебера (из фибробластов) путем совместного культивирования.

Модель повторила признаки LHON по сравнению с нормальными HEK-293. Повышены уровни АФК, митохондриального Ca²⁺, снижен m. Это не нейроны и уж тем более не ганглиозные клетки сетчатки, которые погибают при нейропатии Лебера. Однако эти клетки обладают частично нейрональным паттерном экспрессии, что дает релевантную физиологию, к тому же это легко поддающаяся манипуляциям и масштабируемая линия, подходящая для биотехнологического предприятия.

Наша модель станет первым элементом промышленной тест-системы. На ее основе можно организовать контроль качества серий будущего продукта — тестирование активности каждой серии AAV-вектора в строго воспроизводимых условиях.

— Что будет дальше? Какие следующие этапы запланированы: нейрональные модели, испытания на ганглиозных клетках сетчатки, доклинические исследования на животных?

— Мы показали эффективность в нашей модели, но предстоит доказать, что это переводится в спасение ганглиозных клеток сетчатки и сохранение зрения in vivo. Если на нейрональных моделях и на животных результаты подтвердятся, можно будет говорить о следующем поколении терапии LHON с улучшенной эффективностью.

Наша работа — это оптимизация уже существующего подхода, а не создание его с нуля. Поэтому переход к доклиническим и клиническим испытаниям может быть быстрее, чем для абсолютно новой технологии.

— Почему вы считаете, что путь к практическому применению может быть ускорен, несмотря на то что технология пока находится на доклинической стадии?

— Мы не начинаем с нуля. Мы ориентируемся на технологии, которые уже доказали, что аллотопическая терапия LHON безопасна и потенциально эффективна. Наша задача — не изобретать заново AAV-терапию, а произвести ND4opt c лучшим MTS, что мы уже сделали в клеточной модели. Благодаря промышленно пригодной клеточной линии, четкому продуктовому курсу и возможности опереться на существующие клинические данные мы можем ускорить путь в клинику.

— Чем существующие методы лечения не устраивают врачей и пациентов? Почему они лишь замедляют прогрессирование, но редко восстанавливают зрение?

— На сегодняшний день для лечения применяется идебенон — синтетический аналог коэнзима Q10. Он выступает как искусственный переносчик электронов, частично обходя дефектный комплекс I. Но дефектный белок ND4 остается, и окислительный стресс продолжается.

Клинические исследования показывают, что идебенон дает некоторый шанс на улучшение (особенно при раннем начале), но у большей доли пациентов зрение не восстанавливается, а продолжает падать до уровня слепоты. Он имеет узкое терапевтическое окно. Если пациент обратился поздно, шансы минимальны.

— Если ваша технология дойдет до клиники, чего смогут ждать пациенты? Можно ли говорить о восстановлении утраченного зрения или речь идет только о предотвращении дальнейшей потери?

— Эффект зависит от того, на какой стадии заболевания пациент получит терапию, потому что есть разница между ранней фазой — первые месяцы после начала падения зрения, когда ганглиозные клетки сетчатки (ГКС) еще живы, и поздней фазой, когда значительная часть ГКС уже безвозвратно погибла и зрительный нерв атрофирован. Если пациент на ранней стадии, можно ожидать остановку прогрессирования и частичное восстановление зрения. Если же пациент на поздней хронической стадии, когда прошло несколько лет от начала болезни и глазное дно показывает атрофию диска зрительного нерва (то есть большинство аксонов погибло), то вернуть зрение уже невозможно. Поэтому ранняя диагностика при LHON — это важная часть терапии.

Пресс-служба Научно-технологического университета «Сириус»