Взлом иммунитета бактерий

Исследователи из Московского физико-технического института впервые нашли способ точечного отключения защитной системы у бактерии Bacillus licheniformis — одного из основных микроорганизмов, используемого в мировой биотехнологии для производства ферментов, антибиотиков и других веществ. Это открытие позволит значительно повысить эффективность генетической модификации промышленных штаммов бактерий. Результаты работы опубликованы в журнале International Journal of Molecular Sciences.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

Бактерии защищаются от вирусов с помощью систем рестрикции-модификации (РМ-систем), атакующих чужеродную ДНК. Эта естественная защита долгое время оставалась главным барьером для генетической модификации промышленных микроорганизмов, затрудняя внедрение в них полезных генов.

Ученые МФТИ исследовали новую RM-систему первого типа BlihIA, обнаруженную у бактерии Bacillus licheniformis (один из основных «заводов» промышленных ферментов протеазы и амилазы; используются в производстве моющих средств, продуктов питания, текстиля и биотоплива). Используя секвенирование нового поколения, авторы впервые определили точную последовательность ДНК, которую распознает и атакует система BlihIA.

«Мы не только описали защитную систему, но и впервые показали, что ее работу можно эффективно подавить in vitro с помощью белка ArdB. Ранее считалось, что белки этого семейства работают только в живых клетках, что накладывало ограничения на их изучение и применение. Наша работа меняет эту парадигму»,— рассказал один из авторов статьи, инженер лаборатории молекулярной генетики МФТИ Родион Березов.

Практическая ценность работы — в двух новых стратегиях, которые она предлагает. Во-первых, теперь, зная точную мишень системы BlihIA, ученые могут конструировать плазмиды для генетической трансформации Bacillus licheniformis без этих последовательностей, что позволит им «обходить» защиту бактерии. Во-вторых, они могут использовать сам белок—подавитель ArdB как инструмент для временного отключения RM-системы, что может значительно повысить эффективность трансформации штаммов-продуцентов на основе Bacillus licheniformis.

«Эксперимент был наглядным: очищенный комплекс BlihIA разрезал только специфичную последовательность ДНК. Но при добавлении ArdB процесс разрезания полностью останавливался. Это прямое доказательство влияния ArdB на взаимодействие BlichIA с ДНК»,— добавила первый автор исследования, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики МФТИ Анна Кудрявцева.

Открытие снимает ключевое ограничение для работы не только с этой бациллой, но и с другими промышленно значимыми микроорганизмами, упрощая создание бактерий-продуцентов для фармацевтики, агробиотехнологий и биоразлагаемых материалов.

Анна Кудрявцева, первый автор исследования, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики МФТИ, ответила на вопросы «Ъ-Науки».

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

— Почему бактерию Bacillus licheniformis называют живой фабрикой и с какой главной проблемой столкнулись ученые при попытке улучшить ее свойства с помощью генной инженерии?

— Бактерии рода Bacillus широко используют в биотехнологиях, их любят за то, что эти бактерии умеют секретировать производимые вещества наружу, потому целевые продукты легко очистить. Bacillus licheniformis используют для производства амилаз и протеаз. Амилазы — ферменты, расщепляющие крахмал, критически важны для пищевой промышленности. Протеазы — ферменты, расщепляющие белки. Такие ферменты нужны вообще везде: кормовая, пищевая промышленность, производство моющих средств.

Нельзя сказать, что ученые столкнулись с проблемой. Производственные штаммы — продукт многолетнего труда целых групп ученых, задача которых — придать бактериям необходимые свойства: заставить их вырабатывать амилазу или протеазу в огромных количествах. Но действительно в процессе разработки нового штамма-продуцента ученые могут столкнуться с «неприживаемостью» чужеродной ДНК, то есть бациллы избавляются от ДНК с заданными свойствами.

— Что такое система рестрикции-модификации простыми словами и почему она стала камнем преткновения для биотехнологов?

— Системы рестрикции-модификации — это своего рода «иммунитет» бактерий. Бактерии живут в микромире, где вокруг плавает, лежит или даже летает много чужеродной ДНК. В отличие от нас с вами, многоклеточных эукариот, бактерии с удовольствием поглощают эту чужеродную ДНК. Дальше есть два варианта: можно разрезать новую ДНК и использовать ее в качестве пищи, или же может так произойти, что бактерия будет пользоваться чужеродной ДНК как своей собственной — синтезировать белки, запрограммированные в этой ДНК. Такое явление называется «горизонтальный перенос генов». Понятно, что чужеродная ДНК может нести пользу, давать бактерии новые для нее гены, например устойчивость к антибиотикам. С другой стороны, чужеродная ДНК — не всегда хорошо: это может быть вирусная ДНК, которая заставит бактерию нарабатывать что-то вирусное и совершенно неполезное для бактерии.

Системы рестрикции-модификации специальным образом «метят» хозяйскую (бактериальную) ДНК (модификация) и разрезают (рестрикция) немеченую, чужую ДНК. Биотехнологи — это те люди, которые заставляют бактерию «насильно» поглощать и пользоваться чужеродной ДНК, той, которую они ей подсунули, той, которая «программирует бактерию» на продукцию целевого фермента или какого-то другого вещества. Поэтому обман систем рестрикции-модификации — одна из множества задач, решаемых учеными при разработке штаммов-продуцентов.

— В чем заключается ключевое научное достижение исследователей МФТИ?

— Обычно системы рестрикции-модификации «помечают» и узнают строго определенную последовательность букв ДНК (сайт узнавания). Мы изучили новую систему рестрикции-модификации и описали ее сайт узнавания, то есть буквы ДНК, на которые реагирует эта «иммунная» система. Для этого мы использовали секвенирование нового поколения, позволяющее отслеживать те самые «метки», модификации ДНК. Мы сравнили ДНК, выделенную из бактерий, с нашей

РМ-системой и без нее и «увидели» все отмеченные места (сайты узнавания).

Белок ArdB — результат эволюции систем рестрикции-модификации и тех, кто пытается эти системы преодолеть (вирусы бактерий (бактериофаги) и мобильные генетические элементы — плазмиды). Если вы бактериофаг, вы можете выработать специальный белок ArdB, который будет отвлекать на себя РМ-системы и более успешно заражать бактерию своей чужеродной ДНК. Идея использовать такие белки для более успешной генетической модификации бактерий лежит на поверхности, и мы работаем над разработкой протоколов и внедрением их в реальное производство. В этой работе мы показали, что белок ArdB может in vitro, то есть в пробирке, ингибировать действие РМ-систем.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

— Почему открытие того факта, что белок ArdB работает не только в живой клетке, но и «в пробирке» (in vitro), меняет сложившиеся научные представления?

— Белок ArdB — хитрый, и ученым, нам в том числе, пока не удалось точно разобраться, как именно он мешает работе РМ-систем. Однако он совершенно точно работает. Успешное применение его в качестве ингибитора РМ системы in vitro позволяет нам заявить, что для его работы не нужно каких-то дополнительных ингредиентов. Ранее мы показали эффект ArdB против РМ-систем в живых клетках, в них много разных веществ, никогда не угадаешь, какое именно нужно добавить, чтобы все работало. А здесь мы показали, что ничего не нужно. Это ценно и для возможности дальнейшего применения ArdB в биотехнологии.

— Какие две практические стратегии для генной инженерии предлагают ученые? В чем разница между «обходом» защитной системы и ее «отключением» с помощью белка?

— Да, действительно, если вы знаете, что в вашем целевом штамме сидит РМ, узнающая определенные буквы (вы знаете, какие), то вы можете оптимизировать внедряемую генетическую конструкцию, убрав из нее буквы, вызывающие «иммунный ответ» бактерий. С другой стороны, может сложиться ситуация, когда эти буквы необходимы. Вот тут нам на помощь приходит ArdB.

— Насколько универсальным может быть этот метод и каковы следующие шаги вашей лаборатории?

— Конечно, мы хотим помочь всем и сразу, но на самом деле разработка штаммов-продуцентов — это многолетняя работа огромных коллективов ученых. И проблемы у них возникают не только в связи с системами рестрикции-модификации. Мы можем только надеяться, что при создании очередного штамма продуцента кто-нибудь из разработчиков прочтет нашу статью, уберет сайт узнавания из своей конструкции и, возможно, сэкономит полгода-год своей жизни.

Работа выполнена в рамках гранта РНФ №24-74-00024

Пресс-служба МФТИ