Брак по расчету

Специалисты Санкт-Петербургского государственного университета ветеринарной медицины систематизировали методы определения оплодотворяющей способности сперматозоидов, которые позволяют точнее прогнозировать результаты искусственного осеменения. Исследователи показали: стандартная спермограмма включает в себя определение концентрации, подвижности и морфологии, тогда как для успешного оплодотворения критически важными показателями являются индекс фрагментации ДНК, а также определение оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

Профессор кафедры генетических и репродуктивных биотехнологий СПбГУВМ, доктор ветеринарных наук Елена Корочкина вместе с аспиранткой Татьяной Берелет проанализировали более 110 научных работ российских и зарубежных авторов. Результаты опубликованы в журнале «Аграрная наука Евро-Северо-Востока».

«Довольно часто при проведении стандартных методов оценки качества спермы производителей и определении ее пригодности наблюдается низкая эффективность искусственного осеменения. Даже при нормальных показателях спермограммы оплодотворение может не произойти, потому что оцениваются концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов. В этой связи актуальным является проведение дополнительных методов исследований, а именно определение оплодотворяющей способности»,— говорит Елена Корочкина.

Три этапа до оплодотворения

После эякуляции сперматозоид еще не способен оплодотворить яйцеклетку. Ему предстоит пройти три биохимических процесса в половых путях самки. Первый — капацитация, сложная подготовка клетки к активации. Меняется концентрация внутриклеточных ионов кальция и цинка, повышается pH среды. Происходит перестройка фосфолипидов плазматической мембраны — все это подготавливает клетку к следующим этапам.

Затем наступает гиперактивация: сперматозоид начинает совершать высокоамплитудные асимметричные движения хвостиком, двигаться по неправильной траектории и смещать головку из стороны в сторону. Именно такая подвижность позволяет клетке достичь яйцеклетки в ампулярной части маточной трубы и получить достаточную силу для проникновения через ее оболочки.

Финальный процесс — акросомальная реакция. Из акросомы (структуры на головке сперматозоида) выбрасываются протеазы и гиалуронидаза — ферменты, которые растворяют прозрачную оболочку ооцита и обеспечивают проникновение внутрь. Если хотя бы один из этих процессов нарушен, оплодотворение не произойдет, даже если по внешним параметрам сперматозоид выглядит здоровым.

От теста на зрелость до анализа ДНК

В обзоре ученые систематизировали методы, позволяющие оценить способность сперматозоидов пройти все критические этапы. HBA-тест проверяет, может ли клетка связываться с гиалуроновой кислотой — основным компонентом наружной оболочки яйцеклетки. Зрелые сперматозоиды имеют на мембране рецепторы и останавливаются при контакте с веществом, продолжая активно двигать хвостиком. Незрелые клетки, у которых таких рецепторов нет, проплывают мимо.

Метод Acrobeads определяет целостность акросомы и подвижность одновременно. Подвижные сперматозоиды с интактной акросомой образуют комплекс с иммуноглобулинами, покрытыми антителами. Процесс можно наблюдать под микроскопом в виде агглютинации — склеивания клеток.

Анализ SPA (Sperm Penetration Assay) использует ооциты хомяка без прозрачной оболочки и проверяет функциональную способность сперматозоидов связываться с яйцеклеткой, проникать в нее и подвергаться деконденсации хроматина. Это многоэтапный тест, моделирующий весь процесс оплодотворения в лабораторных условиях.

Когда виноват окислительный стресс

Один из главных факторов, снижающих оплодотворяющую способность,— окислительный стресс, когда количество активных форм кислорода превышает норму. Небольшое количество этих веществ необходимо для капацитации и акросомальной реакции, но избыток повреждает структуру клетки, ее ДНК, белки и липиды.

Для оценки уровня окислительного стресса применяют несколько методов: реакцию с нитросиним тетразолием, определение карбонильных производных в белках, хемолюминесцентный анализ с люминолом. Последний считается наиболее чувствительным: люминометр улавливает световые сигналы от взаимодействия свободных радикалов с реагентом и подсчитывает количество фотонов в минуту.

Повреждения ДНК выявляют методом TUNEL, который маркирует разрывы в цепочках флуоресцентными метками. Метод ДНК-комет показывает степень фрагментации генома: поврежденные участки во время электрофореза мигрируют к аноду, образуя характерный шлейф, напоминающий хвост кометы. FISH-диагностика с флуоресцентными зондами позволяет обнаружить хромосомные аномалии — анеуплоидии и другие нарушения, которые снижают вероятность успешного оплодотворения.

Проблема доступности

Метод swim-up имитирует естественное перемещение сперматозоидов через цервикальную слизь и позволяет отобрать наиболее жизнеспособные клетки для искусственного осеменения. Посткоитальный тест определяет концентрацию и подвижность сперматозоидов в гиалуроновом полимере — аналоге цервикальной слизи.

«Учитывая доступность использования данных методик главным образом с материально-технической точки зрения, а также их высокую стоимость, актуальна разработка отечественных наборов для комплексной диагностики фертильности самцов-производителей»,— говорит Елена Корочкина.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям в рамках программы «Студенческий стартап».

Елена Корочкина, заведующая кафедрой генетических и репродуктивных биотехнологий СПбГУВМ, доктор ветеринарных наук, лауреат премии президента в области науки и инноваций для молодых ученых за 2024 год, ответила на вопросы «Ъ-Науки».

— Насколько универсальна предложенная система? Подходят ли эти тесты для быков, жеребцов, хряков и собак или для каждого вида нужны свои настройки и нормы?

— Универсальных тестов в репродуктологии не существует. Базовый принцип может быть одинаковым, а вот все остальное индивидуально под вид. Возьмите тот же HBA-тест с гиалуроновой кислотой: у быков одна концентрация реагента, у жеребцов — другая, у собак — третья. Если взять протокол для мышей и применить на быках, то получите неверный результат. Поэтому каждый метод приходится калибровать заново под конкретный вид.

— Бывает ли так, что метод, который отлично работает для мышей или человека, дает сбой у коров или свиней? С чем это связано?

— Постоянно. Классический пример — SPA-тест с ооцитами хомяка. В теории он должен оценивать способность сперматозоида проникать в яйцеклетку, на практике у сельхозживотных масса ложных результатов. Дело в специфических белках на оболочке ооцита, а также рецепторах на сперматозоидах. Что прекрасно срабатывает у человека, у коровы может не сработать вообще. Именно поэтому мы и говорим о необходимости отечественных разработок — нужны методы, откалиброванные под сельскохозяйственных животных.

— Если у производителя нашли повреждения ДНК в сперме или окислительный стресс, можно ли его вылечить лекарствами или единственный выход — выбраковывать?

— Зависит от причины. Окислительный стресс, вызванный воспалением или неправильным кормлением, лечится. Например, это антиоксидантная терапия: витамин E, селен, цинк. Что касается генетических поломок в ДНК или хромосомных аберраций, то таких производителей выбраковывают.

— Можно ли по тому, какие именно повреждения обнаружены, понять, чем они вызваны: вирусом, перегревом, плохим кормлением или врожденной генетической поломкой?

— Чаще всего да. Например, тепловой стресс дает специфическую картину: высокая степень фрагментации ДНК, нарушение целостности акросомы, изменение подвижности. Вирусная инфекция — это наличие лейкоцитов в сперме.

— Можно ли по анализам отличить, например, «перегретого» быка от «недокормленного»? Есть ли в сперме какие-то вещества, которые точно укажут на причину стресса?

— Да, есть специфические маркеры. При тепловом стрессе в сперме повышаются белки теплового шока — HSP, это такая защитная реакция организма на высокую температуру. При алиментарных проблемах меняется липидный состав мембран сперматозоидов, видны дефициты определенных жирных кислот. Окислительные повреждения тоже различаются: тиобарбитуровая кислота показывает повреждения липидов, карбонильные производные — повреждения белков. По соотношению этих показателей можно понять причину. Но повторю: чистых случаев почти не бывает, всегда комплекс факторов.

— Если пытаться лечить производителя таблетками или уколами, дойдут ли эти лекарства до семенников? И есть ли вообще смысл лечить взрослое животное или сперма уже повреждена безвозвратно?

— В семенниках существует гематотестикулярный барьер — он защищает развивающиеся половые клетки, одновременно предотвращая проникновение цитотоксинов. Если проблема в окислительном стрессе или воспалении — лечить имеет смысл, но результат будет через два-три месяца, при завершении сперматогенеза. Насчет безвозвратности: если повреждена паренхима семенника — да, это необратимо. В случае временного нарушения метаболического баланса возможно лечение.

— Бывают ли животные, у которых сперма ломается «по наследству»? Может ли предрасположенность к плохой сперме передаваться от отца к сыну и можно ли таких заранее отбраковывать по генам?

— Да, такие случаи описаны. Есть мутации в генах протаминов — это белки, которые упаковывают ДНК в головке сперматозоида. Эти мутации передаются по наследству. Бывают и полигенные варианты, когда виноват не один ген, а комбинация нескольких. Современное генетическое тестирование позволяет выявлять носителей до начала использования в разведении.

— Куда дальше движется эта наука? Можно ли будет через несколько лет вместо оценки «годится / не годится» составлять на каждого быка или жеребца подробный паспорт фертильности и заранее предсказывать, сколько лет он прослужит и не будет ли у его детей проблем?

— На сегодняшний день существует комплекс методик, позволяющих определить фертильность производителя. Большое количество исследований направлено на удешевление этих методик, а также на разработку и усовершенствование оборудования для определения фертильности и комплексного прогноза эффективности использования производителя с учетом его племенной ценности.

Пресс-служба СПбГУВМ