Собрать ген по кусочкам

Исследователи Научного центра трансляционной медицины научно-технологического университета «Сириус» разработали технологию, которая позволяет «собирать» большие терапевтические белки внутри клеток. Это прорыв в области отечественной генной терапии, поскольку многие тяжелые ретинопатии считались неизлечимыми из-за проблем с доставкой больших генов, которые не вмещались в стандартные вирусные векторы.

Работа открывает путь к созданию отечественных препаратов для лечения наследственных заболеваний глаз и других тяжелых заболеваний (гемофилия А, муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, наследственная глухота). Результаты исследований опубликованы в двух авторитетных научных журналах: Frontiers in Bioengineering and Biotechnology и ACS Bio & Med Chem Au.

Наследственные заболевания сетчатки — это целая группа заболеваний, вызванных различными редкими мутациями в геноме организма, которые приводят к тяжелым нарушениям зрительной функции и прогрессирующей слепоте в детском и подростковом возрасте. Для этой группы наследственных заболеваний в широкой клинической практике отсутствуют эффективные методы как диагностики, так и терапии. В последние несколько лет наблюдается большой интерес и прогресс к применению методов генной терапии в офтальмологии, что подтверждается регистрацией препарата за рубежом (Luxturna, FDA, 2017) и большим количеством публикаций по этой теме за последние пять лет. В рамках госпрограммы «Наука» федеральной территории «Сириус» ученые направления «Генная терапия» Научного центра трансляционной медицины университета «Сириус» работают над масштабным проектом по разработке препаратов и технологий для лечения наследственных ретинопатий. Исследователи предполагают точечно вводить в сетчатку глаза препарат со здоровым геном, восстанавливая утраченные в ходе мутации функции. Так можно наиболее эффективно предотвратить и замедлить процесс развития заболеваний. Но одна из главных проблем такого подхода заключается в том, что многие гены, связанные с наследственными заболеваниями сетчатки, слишком крупные и не помещаются в стандартные аденоассоциированные вирусы (AAV) — наиболее безопасные и надежные векторы для доставки генетического материала. Чтобы решить эту задачу, ученые «Сириуса» применили механизм белкового сплайсинга — природный процесс, в котором специальные молекулы (интеины) помогают двум половинам белка соединяться в единую функциональную молекулу.

В первой серии экспериментов исследователи протестировали технологию на модельном белке GFP, часто используемом в биотехнологиях из-за удобной для визуализации результата флуоресценции. Белок был разделен на две части, а затем успешно «собран» обратно внутри клеток человека с помощью механизма интеинового транс-сплайсинга. Ученые показали, что методика работает не только в стандартных клеточных линиях эмбриональной почки (НЕК293), но и в клетках эпителия сетчатки (ARPE19). Более того, оптимизация конструкции позволила увеличить эффективность сборки белка до 70%.

На втором этапе команда (совместно с коллегами из лаборатории био- и хемоинформатики НИУ ВШЭ) провела молекулярное моделирование и мутагенез интеинов, чтобы повысить скорость и эффективность реакции сборки целевого белка. В результате удалось создать усовершенствованную систему, которая позволила увеличить количество собираемого белка в полтора раза за счет увеличения эффективности до 80% и скорости реакции.

Технология уже была использована для создания прототипа препарата для терапии болезни Штаргардта — одной из наиболее распространенных форм наследственной макулярной дегенерации. Разработанный генетический конструкт проверили в клетках человека и на животных моделях: после раздельного введения двух векторов в глаз мыши ген был доставлен в фоторецепторы сетчатки, где далее был собран терапевтический белок, уровень которого был в два раза выше по сравнению с контролем у здоровых мышей.

Исследователи показали, что технология одинаково эффективно работает в клетках человека и мыши. Это открывает возможности для заместительной терапии и доставки генов, которые ранее считались слишком большими для классических методов. На текущем этапе работа сосредоточена на проверке биологической безопасности и терапевтической эффективности полученного прототипа препарата in vivo. В случае подтверждения этих данных на данной основе можно будет создавать новые препараты для терапии ретинопатий и сотен других наследственных заболеваний.

Стоит отметить, что в рамках этого проекта исследователи «Сириуса» разрабатывают как подходы генозаместительной терапии (доставка полной копии или укороченной версии гена) с помощью различных природных и синтетических AAV, так и подходы, связанные с применением генетических редакторов, доставляемых с помощью вирусных и невирусных систем (липидные наночастицы, LNP). Это позволит сравнить эффективность и безопасность используемых технологий, выбрать наиболее оптимальное решение и применить его при разработке отечественных препаратов для лечения наиболее сложных и распространенных форм наследственных заболеваний. Разработка подобных препаратов передовой терапии является одним из ключевых национальных приоритетов развития отечественной науки и медицины в области формирования персонализированной медицины и развития высокотехнологичного здравоохранения

Андрей Бровин, младший научный сотрудник направления «Генная терапия» Научного центра трансляционной медицины, выпускник первого набора аспирантуры по специальности «молекулярная биология» университета «Сириус», ответил на вопросы «Ъ-Науки».

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

— В чем заключается фундаментальное прорывное решение вашего метода? Можно ли сказать, что вы создали своего «молекулярного курьера», который доставляет крупный ген по частям и собирает его прямо внутри клетки-мишени?

— Подобные работы уже были описаны ранее в иностранной литературе, а «молекулярный курьер» в виде аденоассоциированного вируса был использован в терапии уже 30 лет назад. Мы же разработали «улучшенное» решение для преодоления естественного ограничения грузоподъемности используемого курьера с помощью системы белкового сплайсинга. Этот механизм позволяет делить большую белковую молекулу на две части, доставить в клетку с помощью вирусов по отдельности и далее собрать ее в клетке с помощью вспомогательных белков — интеинов. В рамках фундаментальных исследований нам удалось обнаружить связь между изменениями химических параметров (распределение свободной энергии по поверхности молекул) и биологических эффектов (эффективность и скорость реакции сплайсинга). Результаты подробно описаны в статье ASC BioMedChem. По данным фундаментальных исследований, нам удалось ввести точечные мутации в последовательности вспомогательных белков, которые позволили собирать терапевтические белки с эффективностью 80% и двукратным увеличением количества белка по сравнению с контрольной группой. Эти результаты будут в ближайшее время опубликованы в нашей следующей статье в журнале BioCommunications.

— Как именно ваша система решает проблему вместимости вирусных векторов, которая долгое время считалась непреодолимым барьером для генной терапии многих наследственных заболеваний?

— Проблема решается довольно очевидным способом — разделением большого гена на две части и дальнейшей доставкой каждой из частей в своем вирусном векторе. Неочевидной особенностью разделения является молекулярный дизайн, который происходит на уровне белковой молекулы, а не гена, как это было сделано в других приложениях. Ключевыми преимуществами белкового сплайсинга являются его высокая скорость и направленность данного механизма, поскольку генетический сплайсинг намного менее эффективный и контролируемый процесс. Наша система для раздельной доставки, состоящая из двух вирусных векторов, позволяет доставлять ДНК в количестве 3,5 нуклеотида в каждом векторе и далее собирать большие белки (с кДНК размером 6–7 тыс. нуклеотидов). Таким образом можно существенно расширить список генов, доступных для заместительной генной терапии.

— Насколько ваша технология универсальна? Можно ли на этой основе создать «конструктор» для терапии других заболеваний, связанных с крупными генами: гемофилии А или миодистрофии Дюшенна?

— Технология полностью универсальна, что уже было протестировано в нескольких предыдущих и довольно свежих работах иностранных коллег на примере применения методов белкового сплайсинга для разработки препаратов-прототипов терапии гемофилии А или миодистрофии Дюшенна.

В нашей первой работе, опубликованной в журнале Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, мы подробно описали и протестировали алгоритм сначала разборки флуоресцентного белка GFР, а далее и его успешной сборки с помощью интеинов группы DnaE (интеины — вспомогательные белки, реализующие реакцию белкового транс-сплайсинга в клетках прокариот и эукариот), мы подтвердили универсальность работы алгоритма уже в целевом терапевтическом белке. Поэтому данная статья — это по факту готовая инструкция по разработке препаратов генной терапии, использующих механизм транс-сплайсинга, и отчет о прохождении первой стадии in vitro тестов с учетом подбора условий, увеличивающих эффективность реакции сплайсинга до 80% на уровне плазмидной трансфекции и вирусной трансдукции.

— Какие основные риски несет подход со сборкой белка внутри клетки и как вам удалось достичь 80% эффективности этого процесса?

— К основным наиболее предсказуемым рискам может относиться избыточная беловая нагрузка, которая получается в ходе работы механизма белкового сплайсинга. Этот эффект возможен из-за того, что используемые вспомогательные белки (интеины) отсутствуют как класс в высших эукариотических организмах (животные и человек). В связи с этим возможна неправильная или некорректная работа (протеосомных) комплексов для уничтожения белков-интеинов, однако исследования биологической безопасности еще предстоит провести на этапе доклинических исследований с привлечением нокаутных животных. На текущий момент была показана только эффективность работы препарата на уровне клеток и дикотипных животных, но это уже является первым важным и значимым этапом для развития данной технологии.

— Когда можно ожидать появления первых отечественных препаратов на основе этой технологии и для каких заболеваний они будут созданы в первую очередь?

— В ближайшей перспективе мы можем говорить о проведении еще пилотных доклинических экспериментов только на мышах. При успешном прохождении данной стадии необходимы дальнейшие испытания, которые в среднем по стандартной процедуре могут занимать от 10 до 15 лет. Точный срок определяется спецификой каждого отдельно взятого заболевания, частотой встречаемости и многими другими факторами.

Приоритизация генетических заболеваний со стороны разработки заключается в удобстве работы с моделями на этапе in vivo. Самыми удобными являются офтальмологические модели (различные формы наследственной слепоты), самыми наглядными — модели других сенсорных заболеваний (глухота или комплексная слепоглухота), самыми востребованными — метаболические заболевания (фенилкетонурия, муковисцидоз), самые сложные — спинальная мышечная атрофия (СМА), дистрофия Дюшенна, сложные формы гемофилии.

Чем физически меньше исследуемый орган и чем он меньше вовлечен в функционирование всего организма, тем проще производить разработку препаратов. Поэтому глаз и внутреннее ухо являются на текущий момент самыми простыми объектами для заместительной генной терапии.

В случае гемофилии и клеток крови основными проблемами являются их крайне быстрый рост и постоянное обновление клеток, поэтому редактирующая терапия может дать намного больше результатов, над чем мы также работаем в рамках гранта федеральной территории. В случае дистрофии Дюшенна и СМА дозировка определяется на килограмм массы тела, поэтому технология сильно завязана на масштабировании объемов наработки вирусных препаратов. В лабораторном формате наиболее удобными являются офтальмологические и кохлеарные заболевания, поэтому наиболее вероятно появление отечественных препаратов для генной терапии разных форм наследственных ретинопатий (слепоты) и нейросенсорной тугоухости (глухоты).

Пресс-служба научно-технологического университета «Сириус»