Всем известную лимонную кислоту в промышленных масштабах получают вовсе не из лимонов. Она образуется при ферментации сахара мицелиальным грибом Aspergillus niger. Ее получение можно отнести к разряду микробиологического производства, когда в результате жизнедеятельности микроорганизмов получают те или иные вещества, к примеру, большинство антибиотиков и витаминов производят именно таким способом.
Биотехнология позволяет создавать с помощью микроорганизмов компоненты, являющиеся сырьем для химической промышленности и получаемые из возобновляемых источников, например, микроорганизмы могут поглощать крахмал или глюкозу, а вырабатывать нужный продукт. Департамент энергетики США еще в 2004 году опубликовал список 12 веществ, которые в ближайшем будущем будут производиться из биомассы и придут на смену продуктам нефтехимии. В этот список входит и янтарная кислота (succinic acid).
Янтарная кислота содержится не только в янтаре, о чем можно догадаться из ее названия, но и в организме человека. Янтарную кислоту используют в фармацевтике как биологически активную добавку, а также в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки. Ее соль, сукцинат — это мощный антиобледенитель, не наносящий вред природе. Одно из перспективных направлений ее использования, получающее только сейчас свое развитие, — это производство из нее биодеградируемых пластиков, которые будут пригодны для формовки пластиковой посуды и упаковки. Янтарная кислота востребована, поэтому один из ключевых вопросов сегодня — как сделать ее получение дешевым и отвечающим требованиям по сбережению энергоресурсов, т.к. основной ее источник — это нефтепродукты. Поскольку янтарную кислоту в ходе метаболического процесса образуют многие микроорганизмы, ее можно получать и с помощью биотехнологии. "Большим преимуществом биосинтеза янтарной кислоты по сравнению с химическими методами ее получения является, прежде всего, более высокий уровень безопасности — малая возможность появления токсичности в получаемом препарате, а также его близость по конформерному составу к природному метаболиту", — комментирует д.б.н. Игорь Григорьевич Моргунов, заведующий лабораторией аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН.
В Европе и США уже построено несколько пилотных заводов, где янтарную кислоту продуцируют штаммы бактерий. Однако это довольно дорогостоящее производство, поскольку в ходе процесса выработки бактериями кислоты приходится добавлять щелочь КОН и серную кислоту, которые составляют примерно 50% от себестоимости продукта.
Кристаллизация янтарной кислоты в культуральной жидкости при температуре 30°C (янтарная кислота еще не выделилась)
Фото: "ГосНИИгенетика"
Поиски способа выработки янтарной кислоты без добавления этих дорогостоящих компонентов ведутся не только в Европейских странах. В России несколько научных групп проводят подобные исследования. Например, группа ученых из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов при ФГУП "ГосНИИгенетика" решила найти способ получения янтарной кислоты без добавления КОН и Н2SO4. Суть уже существующей технологии заключалась в том, что в ферментер (емкость, где наращивается биомасса) постоянно подается глюкоза. Бактерии в ферментере в анаэробных условиях, то есть без кислорода, поглощают ее, растут и выделяют янтарную кислоту. По мере накопления кислоты рН начинает снижаться, а бактерии при этих условиях не могут нормально осуществлять свою жизнедеятельность. В связи с этим в ферментер добавляют щелочь КОН, в результате реакции с кислотой образуется соль, а рН нормализуется. Н2SO4 добавляется для того, чтобы при очистке получить из соли янтарную кислоту.
Кристаллизация янтарной кислоты в культуральной жидкости при температуре 4°C (после охлаждения янтарная кислота выпала в осадок)
Фото: "ГосНИИгенетика"
Разработчики из "ГосНИИгенетика" под руководством д.б.н., профессора Сергея Павловича Синеокого создали продуцент, который может вырабатывать янтарную кислоту при низких рН, что избавляет от необходимости добавления щелочи и серной кислоты. Бактерии, ранее являвшиеся продуцентом, заменили на грибы, а именно на рекомбинантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, поскольку он может вырабатывать кислоту в аэробных условиях. Кислород снабжает клетки продуцента энергией, необходимой для жизнедеятельности клетки при низких рН. "Механизм токсичного действия слабых органических кислот основан на их способности беспрепятственно проникать внутрь клетки, приводя к нарушению ряда клеточных процессов. Устойчивость же к ним сопряжена с активным выбросом протонов и анионов за счет энергии гидролиза АТФ. Вне клетки протоны и анионы вновь объединяются, и цикл может повторяться снова и снова. Жизнеспособность клетки в таких условиях будет зависеть от ее способности быстро регенерировать энергию и осуществлять выброс токсичных ионов быстрее, чем они проникают обратно в клетку посредством пассивной диффузии", — объясняет разработчик — к.б.н. Тигран Владимирович Юзбашев.
Еще одно преимущество дрожжей перед бактериями состоит в том, что эукариоты в большей степени, чем прокариоты способны адаптироваться к низким значениям рН среды.
Сам процесс образования янтарной кислоты в клетках продуцента решили вести по окислительной ветви цикла Кребса (он отражает последовательность превращения кислот в живых организмах в аэробных условиях). Для этого с помощью методов генной инженерии в штамме дрожжей Yarrowia lipolytica инактивировали ген, кодирующий сукцинатдегидрогеназу.
"Мы выключили у дрожжей ген сукцинатдегидрогеназы, в результате чего получили штамм, который не способен функционировать иначе, кроме как продуцируя янтарную кислоту. А дальше методами классической генетики оптимизировали штамм, чтобы он лучше рос и был устойчив к продуцируемой кислоте", поясняет Тигран Владимирович Юзбашев.
Процесс очистки янтарной кислоты стал более простым: после удаления биомассы из культуральной жидкости, среды, где функционировали микроорганизмы, пробирки охлаждают и янтарная кислота выделяется путем кристаллизации. Далее янтарная кислота проходит более глубокую очистку.
Разработчики признают, что аэробный процесс сопряжен с большим расходом субстрата, необходимым для дыхания клеток, но в сравнении со стоимостью щелочи и серной кислоты, применяемых для выработки кислоты в анаэробных условиях, их технология значительно экономичнее.
"Ученые из ФГУП "ГосНИИгенетика" разработали хороший, конкурентный процесс получения янтарной кислоты на основе генетически-модифицированного мутанта дрожжей Yarrowia lipolytica. В ИБФМ РАН также разработана технология получения янтарной кислоты с помощью дрожжей. Было бы неплохо, если частные компании обратят внимание на эти разработки и будут поддерживать биотехнологии как одну из передовых областей", — заключает Игорь Григорьевич Моргунов.