Флуоресцентная микроскопия, получившая широкое распространение в последние полвека, основана на способности облученных микрообъектов светиться. Когда свет действует на исследуемое вещество, электроны, получив энергию света, повышают энергетический уровень. Но любая физическая система стремится к равновесию, и часть полученной энергии возвращается (тоже в виде света) при достижении стабильного состояния. Поглощенная и испущенная энергия не одинаковы, часть рассеивается без излучения; это становится причиной увеличения длины световой волны ("стоксов сдвиг").
Флуоресцентный микроскоп вообще-то — потомок лупы; от нее его отличает сложная линзовая система и источник ультрафиолетового излучения (лазер или дуговая лампа), а также возбуждающий и запирающий фильтры, отсекающие лучи определенной длины волны.
Молекулы большинства веществ не обладают способностью к флуоресценции, но можно заставить их это делать, использовав флюорохромы — светящиеся красители. Главный недостаток флуоресцентной микроскопии — физические ограничения. Из-за дифракции света (способности огибать преграды) точка микроскопического изображения предстает не точкой, а световым пятном, окруженным темными и светлыми кольцами. Диаметр центрального пятна приблизительно равен длине волны света, то есть примерно в 100 раз больше размеров молекулы, испускающей этот свет. Если молекулы находятся близко друг к другу, пятна сливаются. Дифракционный предел не позволяет различить в микроскоп объекты, расстояние между которыми менее половины длины волны излучения. Самое коротковолновое излучение для возбуждения флуоресценции — ультрафиолет с длиной волны в 400 нм, поэтому верхней границей разрешающей способности оптического микроскопа остается 200 нм.
Молекулярное разрешение в линзовой микроскопии считалось недостижимым — до изобретения Андрея Климова, предложившего новый принцип исследования объектов с помощью светящихся красителей и модифицированного флуоресцентного микроскопа. Его прибор позволяет увидеть на два порядка больше деталей, чем обычный флуоресцентный микроскоп, поэтому разработчики называют его флуоресцентным наноскопом.
Метод предлагает использование "запертых" красителей, в которых содержатся химические группы, блокирующие флюорофоры: это позволяет веществу не проявлять флуоресцентных свойств, пока не произойдет "отпирающего" воздействия — например, ультрафиолетового излучения.
Но активирует ультрафиолетовая вспышка флуоресценцию только части молекул красителя, и флуоресцирующие частицы видны раздельно — как пятна диаметром приблизительно 500 нм. Эти пятна фиксируются видеокамерами, изображение передается в компьютер. Активированные частицы постепенно обесцвечиваются. Новая вспышка ультрафиолета активирует новую группу, и процедура повторяется. Компьютер в конце концов строит целостное изображение исследуемого объекта. Дмитрий Климов, сын разработчика флуоресцентного наноскопа и генеральный директор компании "Стереоник", занимающийся поиском инвесторов для производства прибора, объясняет:
"Если бы было несколько молекул рядом, то пятна бы сливались; невозможно было бы отличить: две или десять молекул находятся в объеме. Но за счет поочередной активации мы можем быть уверены, что одно пятно — это одна флуоресцирующая молекула". Разрешающая способность нового прибора, по данным Дмитрия Климова, приближается к 20 нм для движущихся микрообъектов и 2 нм — для статических. Способ флуоресцентной наноскопии предусматривает и возможность использования флуоресцентных красителей с разными активными химическими группами — они связываются с разными типами молекул: например, исключительно с белками или только с нуклеотидами.
У метода Климовых есть модификация, в которой вместо "запертых" красителей используются флуоресцирующие трассирующие наночастицы размером меньше длины волны излучаемого ими света. Модификация основана на броуновском движении: флуоресцирующие частицы постоянно меняют свое положение, эти изменения многократно фиксируются и вводятся в компьютер; так преодолевается дифракционный предел. Координаты мечущейся флуоресцирующей частицы определяются с точностью до 2-3 нм. После сопоставления данных, полученных во всех кадрах, ученые располагают информацией о местах, где были зарегистрированы наночастицы: недоступные для их движения зоны — плотные структуры (например, белки или остатки клеточных мембран) — в компьютере выглядят темными, а места, где наночастицы бывали часто, — светлыми.
Изобретение позволит строить и трехмерные модели объекта. "В одной системе освещения", — описывает механизм построения изображения Дмитрий Климов, — "объектив собирает свет и направляет его в сторону двух видеокамер, свет равномерно распределяется между видеокамерами. Одна из них сфокусирована на одной плоскости объекта, вторая — на другой. За счет того, что мы сфокусировались на разных плоскостях, диаметры пятен предстают различными. И по соотношению диаметров можно вычислять глубину, на которой находится молекула".
Однако говорить о внедрении флуоресцентного наноскопа рано. В России патент на изобретение получен в 2007 году, но полноценного опытного образца так и нет. "Мы все еще находимся в стадии разработки", — сетует Дмитрий Климов. — "Конечно, это далеко не промышленный дизайн, это, скорее, прототипирование. Мы также получили патент в США в 2010 году, в Японии и в Китае проходим завершающие стадии оформления патентов, а также подали патентные заявки в Евросоюзе, Индии и Канаде".
Но и без опытного образца флуоресцентный наноскоп завоевал победу в таких крупных предпринимательских конкурсах, как "Idea Mining", (МФТИ, 2007), HSE{10k} и "Бизнес инновационных технологий" (БИТ-2008); принял участие в финальном этапе SVOD-2008 (Калифорния), стал полуфиналистом на IBTEC-2008 (Калифорния). Наибольшую же известность ему принес международный конкурс инноваций MassChallenge в 2010 году в Бостоне; проект был единственным финалистом из России. Поездку на конкурс MassChallenge поддержала "Российская венчурная компания".
"Стереоник" получил субсидию от департамента поддержки и развития малого и среднего предпринимательства Москвы и госконтракт по программе "Старт" Фонда содействия развитию малых форм предпринимательства в научно-технической сфере. Но этого недостаточно. "Инновационный климат в России, не способствует внедрению новых разработок", — констатирует Дмитрий Климов. — "Покупка высокочувствительной видеокамеры за 50 тысяч долларов, необходимой для опытного образца наноскопа, долгое время оставалась для нас неподъемной задачей. Финансирование научных разработок в России устроено так, что либо ты занимаешься наукой, либо оформляешь бумаги, в том числе пишешь какие-то непонятные объяснительные об отсутствии порнографии, насилия и фашизма в посылке для нас из-за рубежа".
Дмитрий Климов видит применение изобретения и за пределами стандартной микроскопии: "Наш метод даже мог бы сократить затраты на расходные материалы при расшифровке генома человека (а это одно из самых наукоемких направлений для США — рост рынка приближается к 30%) и позволить снизить стоимость определения последовательности нуклеотидов в одном ДНК с пятидесяти до пяти тысяч долларов".
"Предложение Климовых можно свести к правильной идее, что многократное повторение эксперимента приводит к улучшению пространственного разрешения", — отзываются о проекте в Институте биохимической физики имени Н.М.Эмануэля. — "Но улучшение соотношения сигнал-шум будет происходить медленно, и за время эксперимента возможно смещение фактического положения флуоресцирующих молекул — как из-за диффузии, так и из-за разогрева окрестностей флуоресцирующих молекул при каждом акте поглощения энергии фотона". "Время жизни возбужденного состояния, из которого происходит флуоресценция", — объясняют свой скепсис в институте Эмануэля, — "составляет 5-10 наносекунд, при многократных измерениях должно пройти минимум 1000 наносекунд, за это время произойдет диффузия флуоресцирующей частицы, и изображение любого реального объекта исказится".