Сердце из костного мозга

Стволовые клетки могут превращаться в другие, обновляя таким образом ткани тела. В том числе — сердечного миокарда после инфаркта. В новом исследовании ученые МФТИ использовали паракринные факторы, которые выделяют созревающие кардиомиоциты (клетки сердца), чтобы дифференцировать собственные мезенхимальные клетки красного костного мозга пациента. В результате те приобрели основные свойства мышечных клеток миокарда. Работа выполнена при поддержке РНФ (грант №25-65-00037) и опубликована в журнале Biomedicines.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

Одним из самых передовых направлений в медицине стала регенеративная терапия. Ее цель — восстановление поврежденной или пораженной заболеванием ткани с помощью трансплантации или использования стволовых клеток, которые способны дифференцироваться во многие другие типы клеток. Попав в пострадавший орган или ткань, стволовые клетки заменяют собой погибшие. По происхождению они могут быть, например, эмбриональными, фетальными (полученные из зародыша) или индуцированными плюрипотентными (iPSC). Последние получают из других клеток путем их «перепрограммирования». Обычно это сложный и дорогой процесс, однако новая работа российских ученых показала более эффективную и доступную альтернативу.

Исследователи МФТИ, Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М. Ф. Владимирского и Национального медицинского исследовательского центра им. Е. Н. Мешалкина (Новосибирск) разрабатывают методы получения мышечных клеток сердца (кардиомиоцитов) и изучают их свойства. Ученые обратили внимание на мезенхимальные стволовые клетки — те, которые могут превращаться в костную, хрящевую или жировую ткань. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — перспективный материал для лечения повреждений миокарда. То есть самого мощного слоя мышц сердца, который обеспечивает непрерывное сокращение органа всю жизнь человека.

В рамках новой работы мезенхимальные стволовые клетки получали из образцов красного костного мозга пациентов. Это кроветворный орган, где постоянно образуются все новые клетки крови. Его пробы массой 1–2 г извлекли во время операций на открытом сердце, сразу после вскрытия грудной клетки. Далее из образцов выделяли стволовые клетки, которые помещали в среду культивирования, где до того находились кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по стандартному протоколу.

Соответствие полученных из красного костного мозга клеток сердечным подтвердили с помощью иммуногистохимического окрашивания, оптического картирования и метода патч-кламп. Это электрофизиологическая методика для изучения поведения ионных каналов на клеточной мембране, при которой ее фрагмент изолируют с помощью специальной микропипетки и наблюдают проходящие через мембрану ионные токи. Патч-кламп выявил основные типы ионных токов, которые характерны для кардиомиоцитов (натриевые, кальциевые и калиевые).

Под микроскопом ученые различили вытянутую стержневидную форму клеток, что характерно для нормальных зрелых тканей сердца. Более того, у них отметили поперечную исчерченность и спонтанные кальциевые волны (колебания). Так называют повторяющиеся изменения концентрации ионов Ca2+ внутри живых клеток. Они нужны для передачи биологических сигналов и управления внутриклеточными процессами, такими как мышечное сокращение. Выходит, дифференцированные с помощью нового подхода клетки приобрели многие свойства настоящих клеток миокарда. Более того, новые клетки близки к «родительским» (послужившим источником паракринных факторов) по временным характеристикам угасания кальциевых колебаний.

Когда оба типа клеток росли в общей среде (так называемое кокультивирование), их кальциевые колебания синхронизировались. Это говорит о согласованной работе мышечных клеток разного происхождения, которая необходима для нормального сердечного ритма. В то же время интенсивность потока ионов в мембранах клеток соответствовала не вполне зрелым кардиомиоцитам. Клетки проходили дифференциацию по нужному пути, но не полностью ее завершили. Тем не менее биофизики считают, что на фоне синхронизированной активности дифференцированных клеток с кардиомиоцитами они вполне подходят для ремонта тканей и могут стать ценным инструментом для исследований.

Важно, что новый протокол «параллельной дифференциации» устраняет необходимость подстраивания под конкретного пациента, ведь новые клетки получают на основе его собственных. По сравнению с имеющимися альтернативами метод на основе паракринных стимулов проще и эффективнее. Не нужны ни дорогая генная инженерия, ни сложные коктейли из химических веществ. Метод подходит для наработки близких по свойствам к кардиомиоцитам клеток, необходимых при моделировании заболеваний сердца, для фармакологического тестирования новых лекарств, а в будущем, возможно, и для использования в регенеративной медицине.

Разработанный подход позволяет направленно превращать мезенхимальные стволовые клетки костного мозга пациента в кардиомиоцитоподобные клетки с помощью сигнальных молекул, выделяемых iPSC-производными кардиомиоцитами. В ходе работы было показано, что такие клетки приобретают структурные и функциональные признаки сердечной ткани, включая поперечную исчерченность, кальциевые колебания и электрическую активность. По мнению ученых, технология открывает возможности для создания персонализированных моделей сердечных заболеваний, фармакологического тестирования и дальнейшего развития регенеративных подходов после повреждения миокарда.

Вероника Литвиненко, инженер-исследователь лаборатории экспериментальной и клеточной медицины Института биофизики будущего МФТИ, ответила на вопросы «Ъ-Науки».

— Что такое паракринные факторы и почему ученые решили использовать их, а не химические вещества или генную инженерию для превращения клеток?

— Паракринные факторы — это сигнальные молекулы, которые клетка выделяет в питательную среду и которые действуют на другие, соседние клетки. В статье используется кондиционированная среда, собранная от дифференцирующихся кардиомиоцитов, полученных из иПСК (на 20-й день их дифференцировки). Такой подход выбрали вместо химических веществ и генной инженерии, потому что существующие протоколы (химические индукторы, генетические модификации) технически сложны, недостаточно эффективны, небезопасны и требуют долгой индивидуальной настройки под каждую новую линию клеток пациента, а линии МСК у разных пациентов сильно различаются по своим свойствам. Паракринный подход использует уже готовый естественный «набор» сигнальных молекул от отработанного протокола, без вмешательства в гены клетки.

— Почему для эксперимента выбрали именно мезенхимальные стволовые клетки из красного костного мозга, а не эмбриональные или индуцированные плюрипотентные?

— МСК остаются перспективным источником клеток для аутологичной (собственной) терапии именно благодаря их доступности и высокой способности к размножению в культуре, а также иммуномодулирующим свойствам. Эмбриональные стволовые клетки и иПСК в статье упоминаются как клетки, которые тоже успешно превращали в кардиомиоциты в других работах, но здесь иПСК используются не как материал для лечения, а только как «источник» сигнальной среды (инструмент), а не как объект дифференцировки.

— Как именно происходит процесс «обучения» клеток: они просто впитывают сигнальные молекулы из среды или между клетками возникает прямой контакт?

— В основном протоколе — без прямого контакта: МСК просто помещали в кондиционированную среду от иПСК-кардиомиоцитов. Отдельно в статье описан еще один эксперимент — прямое сокультивирование МСК с уже готовым слоем иПСК-кардиомиоцитов, где контакт есть, и именно там мы проверяли, смогут ли клетки функционально «встроиться» друг в друга.

— Какие конкретные признаки подтвердили, что полученные клетки действительно стали похожи на сердечные: форма, белки, электрическая активность или что-то еще?

— Целый набор независимых признаков: спонтанные кальциевые колебания (метод оптического картирования); белок -актинин с четкой поперечной исчерченностью, подтвержденной Фурье-анализом; более вытянутая, «палочковидная» форма клеток; скорость проведения возбуждения по кластеру клеток; а теперь еще и данные патч-клампа — появление потенциалов действия и функциональных ионных токов, которых не было у неизмененных МСК.

— Что показал метод патч-кламп и почему наличие натриевых, калиевых и кальциевых токов так важно для сердечной клетки?

— С помощью метода патч-кламп у полученных клеток мы смогли зарегистрировать потенциал действия (длительность на уровне 80% реполяризации — 50 ± 4 мс) и три ключевых ионных тока: быстрый натриевый ток INa (7,66 ± 1,57 пА/пФ), кальциевый ток L-типа ICa,L (4,35 ± 1,92 пА/пФ) и калиевый ток IKv (15,07 ± 6,06 пА/пФ). У контрольных, недифференцированных МСК этих токов не было — только «пассивные» емкостные сигналы. Само наличие этих трех токов важно, потому что именно они формируют потенциал действия настоящей сердечной клетки: натриевый ток запускает быструю деполяризацию, кальциевый — поддерживает плато потенциала действия и связан с сокращением, а калиевый — отвечает за реполяризацию (возврат клетки в исходное состояние). Их появление — прямое электрофизиологическое доказательство того, что клетки действительно приобрели сердечно-специфический фенотип, хотя плотность этих токов ниже, чем у зрелых взрослых кардиомиоцитов.

— Что такое кальциевые волны и почему их синхронизация с «родительскими» кардиомиоцитами говорит об успешной дифференцировке?

— Это распространяющийся по клетке или группе клеток фронт повышения внутриклеточного кальция, сопровождающий возбуждение. В сокультуре МСК-производных клеток с монослоем иПСК-кардиомиоцитов кальциевые транзиенты и карты активации показали синхронную, скоординированную активность по всему слою. Это значит, что новые клетки не просто прижились рядом, а образовали с сердечными клетками функциональную электрическую связь и стали частью общей возбудимой ткани.

— Почему клетки не достигли полной зрелости и мешает ли это их использованию в медицине или экспериментах?

— Плотность ионных токов оказалась ниже, чем у зрелых взрослых кардиомиоцитов. Это типичный признак незрелости для клеток, полученных в лаборатории. Также значение потенциала покоя (от 40 до 60 мВ) частично совпадает со значением у обычных, недифференцированных МСК, поэтому авторы опираются не на абсолютные цифры, а на качественные различия — само появление потенциала действия и ионных токов, отсутствующих в контроле. Длительность кальциевого сигнала (CaT50 283 мс) также близка к показателю самих иПСК-кардиомиоцитов, которые на этом этапе еще «фетоподобны», то есть незрелы. Это не мешает использовать клетки для моделирования болезней и тестирования лекарств, но пока ограничивает применение в терапии и для крупномасштабного картирования проводящей ткани.

— В чем главное преимущество нового метода перед существующими подходами? Он дешевле, быстрее или безопаснее для пациента?

— Не в дешевизне или скорости самих по себе, а в универсальности: метод избавляет от необходимости индивидуально настраивать протокол под каждую новую линию клеток пациента (что обычно требуется при химических методах), а также исключает риски, связанные с генетическими манипуляциями. Это делает подход более воспроизводимым и масштабируемым независимо от того, насколько по-разному ведут себя МСК разных пациентов.

— Где уже сейчас можно применять такие клетки: для тестирования лекарств, моделирования болезней или непосредственно для лечения сердца?

— Такие клетки хорошо подойдут для моделирования заболеваний сердца в лаборатории, а также для фармакологического скрининга, включая тестирование антиаритмических препаратов. Кроме того, их можно использовать для оценки иммунологической и электрофизиологической совместимости донора и реципиента перед возможной трансплантацией. Не исключено, что они найдут применение и на этапе так называемого прайминга, то есть предварительной подготовки клеток перед аутологичной пересадкой. В более отдаленной перспективе рассматривается возможность включения таких клеток в тканеинженерные конструкции — например, 3D-пластыри или инъекционные материалы для восстановления поврежденного миокарда. Впрочем, прямое лечение сердца этими клетками пока не рассматривается как готовое клиническое решение.

— Как персонализация работает в этом методе: клетки берутся у самого пациента и значит ли это, что отторжения не будет?

— Да, подход строится на собственных клетках пациента: костный мозг берут у того же человека, которому предполагается лечение. Это делает метод изначально персонализированным (аутологичным). Поскольку новые клетки получают из собственных МСК пациента без внесения чужеродного генетического материала или использования эмбриональных линий, риск иммунного отторжения при потенциальной трансплантации значительно снижается по сравнению с аллогенными (донорскими) клетками. Однако это не абсолютная гарантия, и вопрос о долгосрочной совместимости требует дальнейших исследований. На данном этапе мы говорим о снижении риска, а не о его полном исключении.

Подготовлено при поддержке Минобрнауки