«Замковый камень» рака

Ученые из МФТИ, ИБХ РАН и НИИ системной биологии и медицины совместно с коллегами из Южной Кореи и США выяснили, как холестерин на внутренней стороне клеточной мембраны управляет работой рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Этот рецептор запускает деление клеток, а его гиперактивация ведет к онкологическим заболеваниям.

Ранее считалось, что холестерин только подавляет EGFR. Исследование выполнено при поддержке РНФ (грант №23-74-00024), результаты опубликованы в журнале Science Advances. В работе показано, что после связывания сигнальной молекулы EGF холестерин специфически встраивается в «карман» между мембранными доменами активного димера EGFR, стабилизируя его и позволяя передать сигнал внутрь клетки. Без холестерина активная конформация разрушается. Авторы образно называют его «замковым камнем», а роль холестерина определяют как двойственную — в зависимости от стороны мембраны и состояния рецептора.

Ученые впервые напрямую «увидели» это связывание в мембране живой клетки, адаптировав метод коиммобилизации одиночных молекул, подтвердили данные с помощью мутаций, фотообесцвечивания, ЯМР и молекулярной динамики. Они идентифицировали три ключевые аминокислоты (изолейцин-640, глицин-641, лейцин-642), отвечающие за захват холестерина. Их замена полностью блокирует активацию рецептора. Открытие определяет новую мишень для противораковой терапии.

Эдуард Бочаров, старший научный сотрудник Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ, ответил на вопросы «Ъ-Науки».

— Долгое время считалось, что холестерин в мембране только подавляет работу EGFR. Ваше исследование показывает, что он же является необходимым активатором, но с другой стороны мембраны. Почему наука так долго не замечала эту двойственную роль?

— Да, действительно, ранее было показано, что нахождение EGFR в мембранных микродоменах, насыщенных холестерином, ингибирует его активацию, а при связывании лиганда рецептор имеет тенденцию мигрировать из таких микродоменов. В данной работе мы впервые в мире провели тщательное детальное исследование взаимодействия холестерина с EGFR на молекулярном уровне, буквально на расстояниях нанометров и ангстрем. Мы показали, что холестерин динамически (непостоянно) связывается как с мономером EGFR, так и с его неактивной («спящей») димерной формой, при этом данные взаимодействия могут ингибировать активацию рецептора. Но при лиганд-индуцированном переключении рецептора в активное димерное состояние для стабилизации конформации требуется захват молекулы холестерина в специфический карман в цитоплазматической мембранной части димера EGFR, то есть холестерин в данном случае уже действует как необходимый кофактор активации, что раскрывает его двойственную примечательную роль. Необходимо отметить, что система многокомпонентна: помимо холестерина, также большую роль играют другие липиды и адаптерные белки, а также физическое состояние липидного бислоя, что требует дальнейших исследований.

— Вы описали холестерин как «замковый камень», который стабилизирует активную конформацию димера. Что происходит с рецептором в отсутствие холестерина? Почему активная форма без него нестабильна и не может передать сигнал?

— В активной димерной форме трансмембранные домены EGFR в некоторой степени подвижны относительно друг друга, что не позволяет примембранным цитоплазматическим участкам JM-A стабильную антипараллельную димерную конформацию, которая необходима, в свою очередь, для формирования киназными доменами ассиметричного димера, в котором происходит фосфорилирование подвижных С-концевых участков рецептора, что и является в итоге аллостерической передачей сигнала через мембрану. Можно сказать, что холестерин является «замковым камнем», стабилизирующим некую активную конформацию «куклы на ниточках».

— Вы адаптировали собственный метод коиммобилизации одиночных молекул, заменив один из белков на флуоресцентно меченый липид. Что дало это техническое решение? Как вам удалось в реальном времени «увидеть» связывание одиночной молекулы холестерина с рецептором прямо в мембране живой клетки?

— Южнокорейские коллеги успешно адаптировали разработанный ими ранее метод мониторинга коиммобилизации одиночных молекул, чтобы напрямую и в реальном времени проследить взаимодействие флуоресцентно меченого аналога холестерина с молекулой EGFR в мономерной и димерной формах в мембране живой клетки. Как понимаю, на модифицирование метода и на тщательное доказательство его аккуратности и точности ушло несколько лет.

— Как вы исключили возможность того, что холестерин связывается с мономерной формой рецептора? Эксперименты с мутантным EGFR и ErbB2 выглядят убедительно, но не было ли у вас сомнений на промежуточных этапах?

— Начальные измерения указывали, что именно связывание лиганда EGF и переключение рецептора в активную конформацию приводят к захвату молекулы холестерина из цитоплазматической части мембраны. Но требовалась валидация результатов, что логично напрямую было сделать в сравнении с мутантным EGFR и ErbB2, у которых внеклеточный домен (эктодомен) находится в активноподобной вытянутой (extended) конформации, что приводит к частичной димеризации рецептора в активной конформации без связывания лиганда.

— Вы использовали фотообесцвечивание, чтобы подсчитать долю мономеров и димеров. Как этот метод позволяет различить одиночную молекулу и пару и почему без EGF 21,5% рецепторов уже находятся в виде неактивных преддимеров?

— Метод фотообесцвечивания (photobleaching) позволяет изучать образование отдельных комплексов из биомакромолекул, меченных флуоресцентными метками. Если в наблюдаемой точке находится комплекс из нескольких биомакромолекул, каждая со своим флуорофором, то по мере «выгорания» отдельных меток сигнал падает ступенчато, из чего можно точно определить, сколько субъединиц входит в состав комплекса, то есть установить его стехиометрию.

Как правило, битопные рецепторы, такие как рецепторные тирозинкиназы (РТК), в неактивном состоянии находятся в равновесии мономер—димер в зависимости от их локализации и локальной концентрации на поверхности клетки, при этом для некоторых видов характерно димерное «спящее» состояние полностью (например, для ковалентно связанных РТК из семейства рецепторов инсулина). Для представителей семейства рецепторов эпидермальных факторов роста EGFR/ErbB/HER населенность преддимерного неактивного состояния примерно в 20% обычна. Примечательно, в данном «спящем» состоянии фосфорилирование киназных доменов ингибируется, что обеспечивается как белок-белковыми взаимодействиями, так и белок-липидными.

— Замена всего трех аминокислот (изолейцин-640, глицин-641, лейцин-642) полностью блокирует связывание холестерина и активацию рецептора. Что это значит для понимания эволюции рецептора? Почему природа сделала уязвимость такой локальной?

— Да, некоторое эволюционное разнообразие наблюдается. Например, у млекопитающих и птиц сайт захвата холестерина в трансмембранном домене схож по аминокислотному составу, в отличие от остальных групп животных. Таким образом, можно сделать вывод, что по крайней мере для теплокровных позвоночных данный специфический сайт в EGFR функционально важен и его строение определяется определенным консервативным аминокислотным составом. Необходимо отметить, что мы провели пошаговую замену трех аминокислот одиночными мутациями с целью «аккуратно» модифицировать именно сайт захвата холестерина, но не повлиять на интерфейс димеризации мембранной части EGFR в активном состоянии. Например, в трансмембранном домене рецепторов семейства EGFR/ErbB/HER известны одиночные онкогенные мутации в виде заряженных аминокислот, которые кардинально меняют активацию рецептора.

— Вы использовали ядерный магнитный резонанс и молекулярную динамику, чтобы построить модель связывания. Как эти методы дополнили друг друга и что каждый из них дал, чего не мог дать другой по отдельности?

— Необходимо отметить, что все используемые в работе методы дополняли друг друга, что в совокупности позволило нам получить детальную информацию о специфическом взаимодействии EGFR и холестерина на молекулярном и атомном уровнях, а также функционировании рецептора в целом. С помощью метода гетероядерной ЯМР-спектроскопии мы получили прямые экспериментальные данные о сайтах взаимодействия холестерина и его спин-меченого производного с мембранной частью EGFR. Мы также охарактеризовали структурно-динамические изменения в трансмембранном домене и примембранных участках рецептора, вызванные взаимодействием с холестерином в мембраноподобных системах в виде липидных бицелл. Примечательно, что нам удалось зарегистрировать аллостерическую связь конформационных перестроек для внеклеточной и цитоплазматической части рецептора, что отражает в некоторой степени проведение сигнала через мембрану. Методом молекулярной динамики мы детализировали и визуализировали данные специфические взаимодействия и конформационные изменения в наносекундном—субмикросекундном диапазоне в явно заданном липидном бислое, имитирующем мембрану млекопитающих.

— Известно, что статины могут подавлять рост раковых клеток. Можно ли на основе вашего открытия предложить новую стратегию терапии, отличную от простого снижения уровня холестерина в крови?

— Наша цель была выявить роль холестерина в активации EGFR в норме. Теперь, имея информацию о специфическом сайте захвата холестерина в активном EGFR, можно предложить способы блокировки взаимодействия. Но холестерин широко распространен в организме человека и играет разнообразную роль во многих физиологических процессах, поэтому требуется проявить большую аккуратность в разработке стратегий терапии такого плана.

— HER2 (ErbB2) — это онкомаркер рака груди, и его внеклеточный домен уже существует в активноподобной форме. Проверите ли вы, работает ли тот же холестериновый механизм для HER2 и открывает ли это путь к новым ингибиторам для HER2-позитивных опухолей?

— Исходя из аминокислотной последовательности мембранной части рецептора HER2, можно сделать вывод, что схожий сайт взаимодействия с холестерином есть в димере рецептора. Хотя в ряде случаев наблюдается увеличенная экспрессия рецептора HER2 в опухолях. Как правило, HER2 — орфанный (редкий) рецептор, в норме и при патологиях он потенциирует активацию рецепторного комплекса в виде гетеродимера с EGFR (HER1) или HER3. Поэтому вопрос несколько сложнее и требует дальнейшего изучения взаимодействия с холестерином как для самого димера HER2, так и для его гетеродимерных комплексов. Безусловно, можно сказать, что данные исследования могут привести к разработке направленных ингибиторов для HER2-позитивных опухолей или соединений для комплексной терапии рака.

Подготовлено при поддержке Минобрнауки