Дозорные организма
Как пептиды обманывают бактерии
Антимикробные пептиды — природные соединения, способные повреждать оболочки клеток микроорганизмов. Это первая, врожденная линия обороны, призванная не допустить инфицирования организма болезнетворными бактериями. Антимикробные пептиды являются частью иммунной системы людей и животных и могут вырабатываться в том числе кожей и слизистыми оболочками. Много антимикробных пептидов было найдено в пчелином яде, гемолимфе насекомых, а также на коже земноводных.
Фото: Getty Images
Фото: Getty Images
За последние 50 лет было открыто и синтезировано более 3 тыс. антимикробных пептидов. Они вызывают большой интерес у научного сообщества, поскольку представляют собой потенциальную основу для лекарств нового поколения — препаратов широкого спектра действия против вирусов, бактерий и грибов, к которым болезнетворным микроорганизмам будет сложно выработать резистентность.
Антимикробные пептиды могли бы решить проблему постоянно возрастающей смертности от больничных инфекций. Ведь все чаще и чаще бывает, что человек ложится в больницу для рутинной операции и приобретает там серьезное заболевание, которое вызвано микроорганизмами, «прошедшими огонь, воду и медные трубы», иными словами, выжившими после обработки дезинфектантами и выработавшими устойчивость к существующим антибиотикам.
В отличие от известных антибиотиков, воздействующих на физиологические процессы бактериальной клетки, например на синтез клеточной стенки или удвоение ДНК, антимикробные пептиды в первую очередь атакуют клеточную мембрану. Основой клеточных мембран является двойной слой (состоящий из двух монослоев) молекул липидов. Он образует непроницаемый барьер, защищающий живую клетку, в том числе бактериальную, от воздействия внешней среды. Появление в липидной мембране дефектов, проницаемых для ионов и полярных молекул, губительно для клетки и ведет к ее гибели. Антимикробные пептиды в большинстве своем способны создавать такие проводящие дефекты (поры) в мембранах клеток.
Построить модель, связывающую структуру пептида с его свойствами, необходимо, чтобы найти баланс между его цитотоксичностью и антимикробной активностью и приблизиться к решению важнейшей задачи — созданию лекарственных препаратов на основе антимикробных пептидов. К сожалению, широких клинических испытаний антимикробных пептидов пока не проводится. Ученые все еще далеки от понимания связи между структурой пептидов и их способностью бороться с микробами.
Почти 90% известных антимикробных пептидов — это небольшие молекулы, состоящие из менее чем 100 аминокислот. Большей частью они положительно заряжены, поэтому отрицательно заряженная поверхность бактериальной клетки их притягивает сильнее, чем практически нейтральная поверхность эукариотической клетки в человеческом организме. В их структуре имеются как гидрофобные (отталкивающие воду), так и гидрофильные (склонные взаимодействовать с водой) фрагменты. Примерами антимикробных пептидов, активно изучаемых в настоящее время, являются мелиттин и магаинин. Первый выделяется из яда пчел, а второй присутствует в слизи на коже южноамериканских лягушек.
Ученые лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН предложили единую физическую модель, описывающую все изменения в структуре мембраны, которые вызываются антимикробными пептидами в самых разных концентрациях: в большой, в малой и даже в переменной (сначала в малой, а затем в большой). Теоретические модели были подтверждены комплексными экспериментами, в которых изучалось взаимодействие антимикробных пептидов мелиттина и магаинина с модельными липидными мембранами. Результаты теоретических расчетов и экспериментальных работ были опубликованы в двух дополняющих друг друга статьях в журнале Langmuir.
«Фундаментальное предположение нашей модели состоит в том, что антимикробные пептиды, благодаря одновременному наличию гидрофобных и гидрофильных фрагментов, способны частично внедряться в липидный монослой клеточной мембраны,— рассказал доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ РАН Сергей Акимов.— Из-за этого увеличивается площадь монослоя бактериальной мембраны и в нем создается латеральное давление (двумерное давление в плоскости липидного монослоя), распространяющееся от встроившегося пептида. В результате в противоположном монослое замкнутой мембраны создается натяжение, призванное компенсировать дисбаланс площади между двумя монослоями липидного бислоя, и в мембране образуются поры».
Ученые рассмотрели два возможных сценария порообразования. Согласно локальному сценарию, поры возникают в непосредственной близости от пептидов. Их внедрение в мембрану в большой концентрации вызывает формирование пептид-липидных каналоподобных структур.
В нелокальном сценарии расположение пор не связано с положением пептидов. Согласно этому сценарию, пептиды адсорбируются на мембране, сдавливают один ее слой и растягивают другой, из-за чего между слоями возникает дисбаланс латерального давления и натяжения. При образовании пор дисбаланс уменьшается, что и явилось важным открытием, сделанным в этом исследовании.
«Раньше предполагалось, что поры возникают там, где пептиды внедряются в мембрану,— объяснил заведующий лабораторией биоэлектрохимии, доктор физико-математических наук Олег Батищев.— Мы показали, что это не так. Липидные поры возникают из-за того, что встроившиеся в монослой пептиды изменяют площадь поверхности мембраны и создают дисбаланс давления и натяжения. Мембрана рвется от того, что в нее внедрились пептиды, но не обязательно в том же самом месте».
Предложенные гипотезы были проверены экспериментально. Методом локальной фиксации потенциала ученые ИФХЭ РАН измеряли ионные токи и отслеживали возникновение сигналов проводимости. Эти сигналы соответствуют появлению каналов (пор), через которые проходят ионы. Независимо изучалась способность растворенного красителя — кальцеина — проникать через мембрану, что тоже обусловлено формированием пор под действием антимикробных пептидов.
В литературе описаны три вида электрических сигналов, связанных с появлением пор в мембране. «Взаимодействие пептидов с мембраной мы изучаем косвенными методами. Мы регистрируем проводимость и, исходя из проводимости, определяем размер поры. Мы полагаем, что наблюдаемые узкие пики проводимости соответствуют липидным порам, а мультиуровневые пики — пептид-липидным порам, в которых молекула пептида в различной ориентации балансирует на краю поры»,— объяснил Олег Батищев.
Таким образом, ученые ИФХЭ РАН экспериментально и теоретически показали, что антимикробные пептиды деформируют мембрану и способствуют образованию в ней пор. Процесс кардинально зависит от концентрации пептидов. При концентрации пептидов, превышающей пороговое значение, дисбаланс натяжения и давления между монослоями достаточен для разрыва мембраны. Образуются поры, через которые могут проходить большие молекулы. При низких концентрациях пептидов образуются маленькие поры, которые проницаемы только для протонов и непроницаемы для ионов или растворенных молекул красителя.
Интересно, что антимикробные пептиды, адсорбировавшиеся на мембране в малых концентрациях, препятствуют дальнейшему порообразованию. Ученые ИФХЭ РАН сначала обработали мембрану небольшим количеством пептидов (концентрация в 20–40 раз меньше пороговой), а затем увеличили концентрацию выше пороговой. «Результат был удивительным: мембрана была слабо проницаемой для красителя, а электрические пики, соответствующие образованию липидных пор, не наблюдались,— рассказал Олег Батищев.— Таким образом, добавление антимикробных пептидов в низких концентрациях не повреждает, а, наоборот, защищает мембрану от воздействия высоких концентраций пептидов. При низких концентрациях пептидов образуются липидные поры, проницаемые для протонов, поэтому баланс между монослоями выравнивается. В результате при увеличении концентрации пептидов дисбаланс возникает в меньшей степени, и этого недостаточно, чтобы мембрана порвалась».
Способность пептидов связываться с мембраной зависит от наличия в них гидрофильных и гидрофобных аминокислот, что определяется химическим строением пептида. Следовательно, от строения пептида зависит, насколько обработка небольшим количеством пептидов воспрепятствует порообразованию при последующем увеличении концентрации. Эксперименты показали, что небольшие концентрации мелиттина (в отличие от магаинина) подавляют дальнейшее порообразование не полностью.
«Полученные результаты позволяют сделать шаг к терапевтическому использованию антимикробных пептидов,— подытожил Олег Батищев.— Во-первых, через определенные виды взаимодействий между пептидами надо научиться стабилизировать долгоживущие каналоподобные структуры. Во-вторых, показано, что малые концентрации пептидов защищают мембрану, благодаря чему бактерия может обрести устойчивость. От этого зависит дозировка будущего препарата. В-третьих, предварительной обработкой пептидами в малой концентрации можно защитить здоровые клетки, чтобы терапия большими концентрациями была для них безопасной».