«Мы выбрали муковисцидоз»

Научная публикация, изменившая представления о возможностях генетиков, вышла 28 июня 2012 года в журнале Science. Нобелевская ассамблея назвала работу Дженнифер Дудны и Эммануэль Шарпантье «эпохальным экспериментом», и в 2020 году авторам присудили Нобелевскую премию по химии.

Выйти из полноэкранного режима

Развернуть на весь экран

С тех пор технология редактирования генома прошла огромный путь, с ее помощью уже создают новые лекарства, выводят новые сорта растений. Сегодня в мире проводится больше 100 клинических исследований лекарственных препаратов, основанных на системе геномного редактирования, один из них — для лечения бета-талассемии и серповидно-клеточной анемии — получил одобрение в 2023 году. Над чем работают российские ученые и какие проблемы сегодня им приходится решать? Об этом «Ъ-Наука» поговорил с заведующей лабораторией редактирования генома Медико-генетического научного центра имени академика Н. П. Бочкова, к.м.н. Светланой Смирнихиной.

— Светлана Анатольевна, для начала расскажите пожалуйста, что собой представляет система CRISPR/Cas9?

— Эта система чаще всего ассоциируется с ножницами, и действительно, она позволяет разрезать ДНК и заменить ее фрагмент. CRISPR/Cas помогает бактериям и археям защищаться от опасных для них вирусов. Она делит вирусную ДНК на фрагменты, и бактерия включает ее в свой геном. Возможно, это звучит как фантастика, но это естественный природный механизм. Когда бактерия снова встречается с вирусом, она сравнивает последовательность ДНК, попавшую в ее клетку, с той, которую она уже включила в свой геном. Если есть совпадение, то CRISPR/Cas разрезает вирусную ДНК на фрагменты, таким образом лишая вирус возможности делиться и заражать бактерию. Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье показали, что эту систему можно использовать для редактирования генома человека. Стоит отметить, что Нобелевскую премию за это открытие авторы получили всего через восемь лет, обычно ученые могут ждать награду десятилетиями. Белок Cas9, входящий в состав комплекса CRISPR/Cas, разрезает ДНК в том месте, которое мы ему указали с помощью небольшой молекулы. Эта молекула имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, что и нужный нам локус, то есть нуклеотидные последовательности идентичны. После того как мы разрезали ДНК, можно вставить «заплатку», то есть нужную нам последовательность нуклеотидов. CRISPR/Cas9 — четвертый по счету вариант системы, и именно он оказался настолько эффективным в тот период времени, что когда мы говорим «геномное редактирование», то подразумеваем именно его. На сегодняшний день существует уже сотни вариантов системы. Одни позволяют вставлять небольшие фрагменты гена, другие — ген целиком, третьи — менять точечно отдельные нуклеотиды. Осознание, что можно редактировать гены, привело в какой-то момент к тому, что научный мир решил, будто в его руках оказалась панацея от наследственных заболеваний. Это оказалось далеко не так.

— Что ограничивает метод? Почему он не стал панацеей?

— CRISPR/Cas9, несмотря на свою эффективность, имеет целый ряд недостатков. В первую очередь низкая эффективность редактирования и офф-таргет эффект. Система вносила изменения в те участки генов, которые не должны быть затронуты. Это создает риски, в первую очередь, онкологических заболеваний. Кроме того, не всегда эффективность редактирования достаточна для того, чтобы ожидать клинический эффект от препарата. Зачастую низкая эффективность обусловлена последовательностью того гена, который мы хотим исправить. Вторым фактором, который существенно снижает эффективность, является несовершенство систем доставки редакторов в клетки. Существующие методы доставки имеют либо низкую эффективность, либо недостаточный размер, чтобы упаковать редактор. Все вместе это создает преграды на пути получения эффективного препарата для лечения заболеваний. Мы начинали с нескольких долей процента и теперь достигли показателя 25% эффективности коррекции мутации при муковисцидозе.

— Когда вы начали заниматься редактированием и почему пришли в эту сферу? Были ли в России в тот период группы, которые занимались редактированием, или вы стали первыми?

— Мы начали заниматься этой темой через четыре года после публикации статьи в Science, в 2016 году. До этого мы изучали хронический миелоидный лейкоз, но потом было решено полностью сменить тематику и заняться новой, только зарождающейся технологией редактирования генома. У нас был навык работы с бактериями, плазмидами, клетками человека, но в целом редактирование было для нас terra incognita. В первую очередь мы налаживали методы оценки эффективности, трансфекцию, сборку плазмид — это заняло несколько лет. Насколько я знаю, тогда мало кто в России занимался этим методом, мы были первыми или одними из первых.

— Сколько редакторов вы опробовали в лабораторных экспериментах и сколько времени занял поиск самого эффективного?

— Мы опробовали около 35 вариантов редакторов. Когда мы начинали, работа с каждым занимала много времени. Мы анализировали каждый этап, чтобы понять, где происходят ошибки. Первые восемь вариантов мы тестировали не меньше шести лет. Последние 24 варианта мы протестировали всего за два года, и это с учетом подтверждения эффективности редактирования с помощью форсколинового теста и других методов.

— Какими заболеваниями вы занимаетесь?

— Редактирование генома можно применять только для моногенных заболеваний, которые хорошо изучены. Лишь зная генетическую причину болезни, можно разрабатывать методы, которые помогут ее устранить. Поэтому исследования сосредоточены на моногенных болезнях, то есть причина которых — патогенные варианты в одном гене. Мы выбрали муковисцидоз как одно из самых частых тяжелых наследственных заболеваний. Его причина — патогенные варианты в гене CFTR, кодирующем соответствующий белок. Белок формирует в клетках канал, через который происходит обмен ионами хлора. Патогенные варианты приводят к тому, что белок получается нефункциональным, то есть он не может формировать правильно работающий канал. Тяжелые генетические варианты становятся причиной того, что белок практически полностью отсутствует в клетках. У пациентов в легких образуется вязкий секрет, который становится подходящей средой для размножения различных бактерий. Нарушается работа поджелудочной железы, кишечника. Патогенных вариантов гена CFTR может быть огромное количество, сейчас в базе данных есть информации о 1,7 тыс. вариантах. Существующие сегодня таргетные препараты, безусловно, изменили жизнь многих пациентов. Но они нацелены только на определенный спектр мутаций, например, если в клетках совсем не вырабатывается белок CFTR, то препараты оказываются неэффективными. Поэтому разработка геномного редактирования, даже при наличии таргетных препаратов, не теряет актуальности, хотя метод редактирования тоже пациент-специфичный, то есть он действует только на конкретную мутацию. Мы сосредоточились на самой частой мутации для славянских народов — F508del. Из гена CFTR выпадают три «буквы» нуклеотида, что становится причиной болезни. В теории можно будет ввести готовую систему в организм с помощью инфузии или инъекции, далее она сама найдет нужный локус и отредактирует его. В такой конфигурации редактирование будет одним из вариантов генной терапии. Однако это далеко не всегда приносит эффект, кроме того, такой подход сопряжен с большим количеством побочных действий, о которых мы можем пока даже не знать. Поэтому есть второй вариант — генно-клеточная терапия. Например, подход для лечения серповидно-клеточной анемии основан на том, что у пациента берут его клетки крови, исправляют в них мутацию и трансплантируют их обратно в организм. Нет необходимости системно вводить CRISPR/Cas, поскольку достаточно встроить правильный ген только в эритроциты. Тот же подход может быть показан при муковисцидозе, когда разработают подходы к трансплантации клеток в легкие человека.

Недавно мы начали эксперименты с геном DMD, варианты в котором приводят к мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера, Х-сцепленному тяжелому, жизнеугрожающему заболеванию, которое поражает мальчиков. Ген DMD — самый крупный, поэтому так сложно было создать генотерапевтический препарат: вся нуклеотидная последовательность не помещалась в средство доставки. Это заболевание имеет две формы: более тяжелую миодистрофию Дюшенна и более легкую миодистрофию Беккера. Обычно симптомы миодистрофии Дюшенна проявляются в первые годы жизни ребенка. У пациентов поражаются в первую очередь мышцы, проявления заметны с самого раннего детского возраста: дети быстро устают, родители замечают, что они неловкие, часто спотыкаются и падают, но при этом их икроножные мышцы выглядят накаченными. Это происходит из-за постепенного разрушения мышечной ткани, поскольку в организме не вырабатывается защищающий клетки белок дистрофин. Миодистрофия Беккера не такая тяжелая, эта форма приводит главным образом к кардиомиопатиям, которые лечатся стандартными методами. Несмотря на то что оба заболевания возникают в результате мутаций в одном и том же гене DMD, клинически они различаются. Эти различия обусловлены тем, синтезируется ли вообще белок дистрофин или нет, а это, в свою очередь, определяется типом мутации. Если белок синтезируется, то развивается миодистрофия Беккера, если же нет — то дистрофия Дюшенна. В 2014 году в научной литературе появилось описание пациента, которому установили диагноз миодистрофия Беккера, причем в возрасте 23 лет. Как показало молекулярное исследование, у него в гене DMD пропущены 11-й и 12-й экзоны. Экзоны — это участки гена, которые несут информацию о белке, во время сплайсинга они сшиваются. В данном случае из последовательности белка дистрофина выпадает небольшой фрагмент, но в целом белок продуцируется и функционирует, поэтому клиническая картина не очень тяжелая.

К миодистрофии Дюшенна обычно приводят мутации, нарушающие рамку считывания. Рамка считывания — это, по сути, генетический код, в котором зашифрована последовательность аминокислот, из которых собирается белок. Каждые три последовательных нуклеотида кодируют одну аминокислоту, следующие три нуклеотида — следующую аминокислоту и т. д., пока в последовательности не появляется стоп-кодон, указывающий на то, что белок собран и больше аминокислот добавлять не нужно. Если у пациента есть делеция, например, утрата какого-то экзона, то генетический код сбивается и начинают кодироваться новые аминокислоты, а также начинают появляться стоп-кодоны там, где их не должно быть. Это приводит к тому, что образуется неполноценный белок, который сразу разрушается. Но зачастую белок в таких ситуациях даже не синтезируется. Это и происходит при миодистрофии Дюшенна. В нашей лаборатории мы решили попробовать восстановить рамку считывания. Например, можно «вырезать» 11-й и 12-й экзоны — именно в них примерно у 1,5% пациентов выявлены патогенные варианты, приводящие ее к сдвигу. Другой подход, который мы тестируем, — это восстановление рамки считывания путем разрушения сайта сплайсинга. Это позволяет также исключить экзоны, нарушающие рамку считывания, и восстановить синтез белка дистрофина. Это дает возможность пропустить целевые экзоны еще на уровне матричной РНК.

— Каких успехов уже удалось добиться?

— Что касается заболевания муковисцидоз и гена CFTR, то мы сосредоточились на последней модификации системы CRISPR-Cas9, праймированном редактировании. Причем я стала рассматривать этот метод, можно сказать, благодаря случайности. На одной из конференций коллеги стали обсуждать этот метод, однако мне казалось, что дискуссия преждевременная, нужно дождаться публикаций, который подтвердят его эффективность. Очень быстро такие публикации вышли, и мы решили провести эксперименты с этой системой. У нее есть два главных преимущества перед предыдущими системами. Первое — она разрезает не две, а только одну цепь ДНК, это снижает риски внесения дополнительных мутаций как в локус редактирования, так и в весь геном. Второе — возможность строить донорную молекулу непосредственно в месте редактирования, а не добавлять ее отдельно. Это нам дало эффективность исправления мутации в 20% клеток. Для терапевтического эффекта необходимо вставить выпавшие нуклеотиды менее чем в 10% клеток. При этом у системы нет офф-таргет эффектов ни в локусе редактирования, ни в каких-либо других участках генома. Систему направляет короткая РНК, которая по принципу гомологии узнает нужный ей локус. Мы оценили, где еще в геноме может быть похожая последовательность, и нашли несколько десятков участков. При этом мы сфокусировались на генах, варианты в которых ответственны за онкологические заболевания, поскольку внесение мутаций в другие гены не так опасны. Стоит отметить, что даже при работе с классическим CRISPR/Cas9 нам удавалось избежать внесения опасных изменений благодаря использованию точной нуклеазы, которая направляла систему. Дикий тип CRISPR/Cas9 дает около 20% офф-таргет эффекта, это очень много и не подходит для терапевтических целей. В своей работе мы изначально были нацелены на создание лекарственного препарата, поэтому подбирали нуклеазы и типы системы, которые отличаются низким офф-таргет эффектом. Что касается гена DMD, то работа идет быстрее, чем начальный этап экспериментов с CFTR, так как многие технические вопросы нами уже решены. Подобран ряд направляющих РНК — из 30 протестированных вариантов наибольшую эффективность показали шесть. Дальше мы провели эксперименты в культурах клеток HEK и на миобластах человека. Результаты показывают, что нам удается пропустить целевые экзоны. Теперь для продолжения работы нам необходимы клеточные культуры пациентов.

— А какие планы с муковисцидозом? Что должно стать следующим этапом работы?

— Помимо вариантов геномных редакторов мы искали и клеточные модели муковисцидоза. Идея о том, что для работы нужны пациент-специфичные клетки, лежала на поверхности. Заболевание поражает в первую очередь легкие, и, значит, нам нужны модели клеток именно этого органа. Сначала мы думали, что будем работать с легочными органоидами — это 3D-структуры, которые состоят из клеток разного типа. Они позволяют создать полноценную модель органа. Нам удалось их получить в несколько этапов: клетки кожи пациентов мы перепрограммировали в стволовые, а их затем трансформировали в органоиды. Однако мы столкнулись с большой проблемой: в эти структуры оказалось практически невозможно доставить систему редактирования. В итоге пришли к выводу, что более эффективно будет редактировать 2D-структуры — базальные клетки легкого. Эта линия клеток способна к самообновлению и дает начало всем остальным типам дифференцированных клеток легкого. Мы вносим систему редактирования и дифференцируем их в легочные органоиды. Затем для подтверждения эффективности проводим на них функциональный тест, который позволяет оценить работу хлорного канала. Оказалось, что наши легочные органоиды можно использовать для прогноза эффективности существующих препаратов таргетной терапии, CFTR-модуляторов. Нам удалось показать, что ответ органоидов сопоставим с ответом на терапию пациентов. Таким образом, можно оценивать, подойдет препарат конкретному человеку или нет. С технической стороны нам необходимо решить ключевую проблему — повысить эффективность средств доставки. Для этого мы работаем с разными вариантами: вирусные и невирусные средства, псевдовирусные частицы, везикулы. Дальше необходимо перейти к доклиническим испытаниям.

— Для этого необходимы животные модели. С ними тоже есть сложности?

— Дело в том, что наш геномный редактор создан под геномную последовательность человека, а у мышей она несколько иная. Поэтому нам необходимы животные, у которых ген CFTR полностью выключен и при этом вставлен целый человеческий ген CFTR с мутацией или его часть. Такие мыши есть, но мы создаем собственную модель. Мы планируем встроить человеческий мутантный ген CFTR, на который нацелен наш редактор, в геном мыши и продолжить эксперименты с редактированием. Это еще одна «побочная» работа помимо легочных органоидов. Мы рассчитываем, что благодаря ей в нашей стране появятся лабораторные животные, которые могут использоваться для других научных экспериментов.

— Вам удалось значительно продвинуться в решении технических сложностей за достаточно короткий срок. Можно ли ждать отечественный препарат на основе редактирования генома в обозримом будущем?

— К сожалению, чисто научные задачи оказались не самыми сложными. Сегодня большая проблема — это вывод технологии в реальный сектор экономики. Мы выполняли исследования частично по госзаданию в государственном научном учреждении. Теперь необходимо заинтересовать фармкомпании, которые смогут вложить немалые средства и довести технологию до доклинических и клинических испытаний. У нас уже есть партнеры, которые готовы вложить средства в проект на начальной стадии, но сложнее оказалось найти юридическую основу для передачи нашего геномного редактора. Эту проблему нам еще предстоит решить.

Беседовала Юлия Муштакова