Белок, тормозящий старение
Команда ученых синтезировала экзогенный белок и исследовала его свойства
Использование экзогенного белка HSP70 — это перспективный метод лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Паркинсона. Этот белок активизируется в ответ на стресс и защищает клетки от разрушения, поэтому его используют как маркер клеточных изменений в результате старения, а также развития различных патологий, в том числе нейродегенеративных заболеваний.
Фото: Алексей Мальгавко, Коммерсантъ
Фото: Алексей Мальгавко, Коммерсантъ
Однако механизмы его воздействия на клетки головного мозга в норме и при патологии в настоящее время изучены недостаточно. Чтобы детально изучить поведение этого белка и возможные стратегии повышения его уровня в клетках, сотрудники Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта создали синтезированный белок HSP70, а также его С-концевой фрагмент. Команда изучила проницаемость и распределение HSP70 внутри первичных нейронов и астроцитов, а также то, как экзогенный HSP70 меняет митохондриальный метаболизм и митофагию. Было установлено, что данный белок может проникать в нейроны и астроциты и распределяться в митохондриях, лизосомах и в меньшей степени в эндоплазматическом ретикулуме.
Методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии выявлено, что C-концевой фрагмент HSP70 способен увеличивать митохондриальный мембранный потенциал, скорость продукции активных форм кислорода митохондриями, а также активировать митофагию. Также были показаны его защитные свойства в нейротоксической модели с использованием ротенона и клеточной модели болезни Паркинсона с мутациями PINK1 и LRRK2 — экзогенный С-концевой HSP70 значимо снижает количество некротических и апоптотических клеток.
Как все это поможет науке лечить людей, «Ъ-Наука» поговорил с Андреем Винокуровым, научным сотрудником лаборатории клеточной физиологии и патологии ОГУ имени И. С. Тургенева:
— Что такое белки теплового шока?
— Наши клетки постоянно сталкиваются с большим количеством трудностей: недостаток кислорода, слишком высокая или низкая температура, избыток токсичных молекул и др. Для защиты от этих (и многих других) факторов существуют белки теплового шока (от англ. heat shock protein, HSP) — комплекс белков, которые постоянно присутствуют внутри клеток в небольшом количестве, но при возникновении клеточного стресса их содержание может резко повыситься, что помогает клеткам выжить. Эти белки впервые были открыты при «тепловом шоке» клеток, то есть при воздействии высоких температур,— в таких условиях большинство внутриклеточных белков может перестать функционировать из-за изменения их трехмерного строения (пространственной конфигурации). HSP, связываясь с определенными участками других белков, обеспечивают поддержание их нормальной структуры при клеточном стрессе. В дальнейшем было выявлено, что HSP — большое семейство с множеством разных белков, которые отличаются по молекулярной массе, локализации в клетке, а также своей ролью в поддержании жизнедеятельности клеток. Отдельные HSP могут иметь и свои уникальные функции (как HSP70, о котором пойдет речь ниже).
— Что такое экзогенный белок? В чем его особенность?
— Существуют эндогенные белки — то есть белки, которые вырабатываются в наших клетках. Однако достижения в клеточной биологии, генетике, биомедицине позволили также создавать экзогенные рекомбинантные белки, которые в дальнейшем можно использовать в исследованиях. Таким образом, экзогенные белки — это соединения, полученные альтернативным путем (например, бактериальным синтезом с помощью рекомбинантных штаммов), выделенные и очищенные, а затем уже внесенные в среду, в которой растут исследуемые клетки (в нашем случае — клетки головного мозга). Этот метод удобен, так как при необходимости к химической структуре белка можно что-нибудь добавить или, напротив, отделить только ту часть белка, которая отвечает за интересующие нас функции.
— Почему этот белок может использоваться в лечении нейродегенеративных заболеваний?
— Нейродегенеративные заболевания — комплексные и мультифакториальные, то есть в их развитии участвует огромное количество патологических процессов и все вместе они приводят к нарушению функций клеток головного мозга. От некоторых таких патологических процессов — например, от окислительного стресса, дефектов утилизации «клеточных отходов» — нас защищают белки теплового шока и в особенности HSP70. Во многих исследованиях неоднократно демонстрировалось, что HSP70 обладает несколькими функциями, присущими только ему из всего семейства белков теплового шока. Например, он может самостоятельно находить в клетке «поврежденные» белки и обеспечивать их утилизацию, что крайне важно для нормального функционирования.
Так происходит в норме, однако при развитии нейродегенерации участия эндогенного HSP70 становится недостаточно (или же нарушается его регуляция). Если каким-то образом воздействовать на данный белок, это может оказать благоприятные эффекты в лечении таких заболеваний, как болезни Альцгеймера или Паркинсона, и такой подход в настоящее время считается одним из наиболее перспективных.
— Как проходило исследование?
— Экзогенный рекомбинантный HSP70 был получен в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. В условиях нашей лаборатории мы изучали, может ли этот белок быть использован для коррекции патологических процессов на клеточных моделях болезни Паркинсона. Вначале мы убедились, что такой белок проникает через мембрану клеток смешанной нейрон-глиальной культуры (клеточной культуры, в которой растут нейроны и вспомогательные глиальные клетки), а также проверили, в каких клеточных отделах наблюдается наибольшее накопление HSP70 — по результатам исследования преимущественно он локализовался в лизосомах (они отвечают за утилизацию различных молекул), в меньшей степени — в митохондриях (известных как «энергетические станции клетки») и эндоплазматическом ретикулуме.
В дальнейшем мы изучали, как HSP70 повлияет на работу митохондрий, так как именно они являются преимущественной областью нашего интереса. На этом этапе мы в основном использовали фрагмент HSP70, который отвечает за большинство его функций, вместо полноразмерного белка — в будущем это может облегчить создание на его основе лекарственного препарата. Этот фрагмент мы добавляли к нейрон-глиальной культуре, а также клеточную линию фибробластов с мутациями, связанными с болезнью Паркинсона (PINK1, LRKK2).
С помощью конфокальной микроскопии было обнаружено, что HSP70 способен увеличивать митохондриальный потенциал (он необходим для нормальной работы органеллы), а также активировать митофагию — утилизацию поврежденных или старых митохондрий, которые оказывают пагубное воздействие на клетки. Дефекты митофагии часто обнаруживают при болезни Паркинсона, поэтому активация митофагии в нормальных клетках и клеточной модели Паркинсона может оказать выраженный защитный эффект.
На последнем этапе мы проверяли, может ли HSP70 влиять на жизнеспособность нейронов, глиальных клеток и фибробластов в нескольких моделях — токсической клеточной модели с использованием ротенона и в клеточной модели болезни Паркинсона (на фибробластах с упомянутыми мутациями). HSP70 значительно повышал выживаемость клеток во всех экспериментах, предотвращая их гибель как путем некроза («непрограммированной» гибели клеток), так и апоптоза («запрограммированной» гибели).
— Что дают ученым синтезированные белки HSP70?
— В первую очередь потенциал для создания на их основе лекарственного препарата. Синтез белка вне организма человека значительно облегчает возможность разработки препарата, который может содержать обычный HSP70 или отдельный его фрагмент, а также вспомогательные вещества (например, облегчающие его всасывание из желудочно-кишечного тракта), однако все это еще предстоит осуществить.
— Как полученные данные могут быть в дальнейшем использованы в лечении пациентов?
— На данном этапе все существующие в мире препараты на основе экзогенных HSP70 проходят только доклинические исследования в отношении нейродегенеративных заболеваний — на клеточных культурах и модельных организмах. Как только один из этих препаратов продемонстрирует убедительную эффективность и безопасность, можно будет переходить к полноценным клиническим исследованиям.
В случае успеха у пациентов с самыми разными нейродегенеративными заболеваниями (не только с болезнью Паркинсона, но и, например, с болезнью Альцгеймера) появится новый препарат, который может оказаться куда эффективнее существующих симптоматических средств. Разумеется, пока что судить об этом слишком рано, однако уже полученные научным сообществом результаты выглядят многообещающе.
Работа опубликована в журнале Molecular Neurobiology командой лаборатории клеточной физиологии и патологии Научно-технического центра биомедицинской фотоники ОГУ им. И. С. Тургенева в сотрудничестве с Институтом биофизики клетки РАН, лабораторией «Молекулярная нейробиология» Академии биологии и биотехнологии им. Д. И. Ивановского Южного федерального университета, Институтом молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, а также Университетским колледжем Лондона