Биологи из лаборатории молекулярных биотехнологий ФИЦ «Институт цитологии и генетики СО РАН» по программе Курчатовского геномного центра создали технологию получения из природных микроорганизмов ферментов для промышленности — от продуктовой и химической до фармацевтической. С помощью ферментов можно производить целый арсенал моющих средств, красителей, пищевых продуктов, лекарственных препаратов.
Горячие выходы в кальдере вулкана Узон, Камчатка
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Горячие выходы в кальдере вулкана Узон, Камчатка
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Как в Новосибирске конструируют микроорганизмы для промышленных гигантов
«Генные технологии сегодня широко применяются для создания штаммов микроорганизмов суперпродуцентов (производителей ферментов) и технологии получения ферментативных препаратов для нужд пищевой и целлюлозно-бумажной промышленности, производства синтетических моющих средств и лекарственных препаратов,— говорит заведующий лабораторией молекулярных биотехнологий Института цитологии и генетики СО РАН, кандидат биологических наук Сергей Пельтек.— Целью проекта, который из лабораторного превратился в крупный и федеральный, стало создание штаммов и ферментов на основе генетических технологий. Ученые секвенировали более двух тысяч геномов природных штаммов и получили целую базу геномов биологически значимых микроорганизмов».
Биотехнологии в промышленности
За последние 20 лет применение ферментов в промышленности только росло. Ни одно производство — от производства глюкозных сиропов и пивоварения до очистки сточных вод — сегодня не обходится без ферментов. Применение ферментов в пищевой промышленности связано с их способностью регулировать процесс брожения при производстве спиртов, а также удерживать углекислый газ в поднявшемся тесте. Без ферментов невозможно производство кисломолочной продукции, сыров, обработка кожаных изделий. В медицине используются ферменты, заживляющие раны или, например, разжижающие кровь и рассасывающие тромбы, расщепляющие ферменты, аналогичные человеческим («Мезим», «Креон»), а также ферменты, замедляющие или блокирующие какие-то негативные реакции. Благодаря содержанию в организме человека определенных ферментов производятся различные анализы крови для установления диагноза. В производстве синтетических моющих средств используются ферменты, растворяющие самые стойкие загрязнители — пятна от шоколада, ягод, жира. В производстве животных кормов используется целлюлаза — фермент, расщепляющий целлюлозу (траву, сено, комбикорм), а в качестве природного отбеливателя при производстве бумаги используется ксиланаза.
Утилизировать 6,5 млн тонн лигнина с Байкальского ЦБК
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Проект Института цитологии СО РАН сосредоточен на получении ферментов, которые являются природными катализаторами целого ряда химических процессов, в том числе нейтрализации вредного отхода при производстве бумаги — лигнина. Выбросы лигнина в водоемы высокотоксичны, поэтому для получения разрешения на строительство целлюлозно-бумажного комбината необходимо представить документацию на технологию, в которой выбросы лигнина будут минимальны.
Ликвидацией накопленного лигнина на Байкальском ЦБК занимаются уже десять лет, с 2013 года, и вопрос до сих пор не решен, поскольку ни превратить 6,5 млн тонн лигнина в монолит на цементной основе, ни закомпостировать все эти отходы не получается. Оптимальным решением проблемы было бы превратить лигнин при помощи ферментов и микроорганизмов в нетоксичные продукты распада. В Лаборатории молекулярных биотехнологий проводится исследование деградации отходов до низкомолекулярных соединений с помощью системы LECO Pegasus 4D, включающей полную двумерную газовую хроматографию с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором.
Заповедники, ледники, вулканы и свалки
Основные источники получения микроорганизмов, которые «размножают» в лаборатории,— это термальные воды Курило-Камчатского вулканического пояса, Северного Прибайкалья, Восточных Саян, соленых озер Дагестана, Новосибирской области и Алтайского края, а также образцы из отвалов и шламов горнодобывающей промышленности Кемеровской области.
«В частности, из термальных источников выделено 350 штаммов микроорганизмов, а 44 штамма выявлено на среде с нефтью и дизельным топливом»,— говорит кандидат биологических наук Алла Брянская, старший научный сотрудник Лаборатории молекулярных биотехнологий Института цитологии СО РАН. Всего же в коллекции микроорганизмов ФИЦ ИЦиГ СО РАН насчитывается свыше 3 тыс. культур.
Примечательно, что микробиологи по традиции присваивают название штаммов по месту их нахождения. Например, штамм микроорганизма, расщепляющий лигнин, носит название «Артыбаш», поскольку он был найден в озере около одноименного алтайского поселка. В коллекции имеются штаммы с названиями «Гарга», «Алла» (горячие источники в Бурятии), «Сухая» (горячий источник на Байкале), «Мутновский» (горячий источник на Камчатке).
Древнейшие экстремалы планеты
Почему ученые выбирают такие экзотические источники для своих ферментов? Для любой промышленности нужны термостойкие ферменты, которые способны работать в агрессивных средах. В частности, галофильные микроорганизмы растут на солончаках и в жидкостях, содержащих высокие концентрации натриевой соли. Организмы, устойчивые к солям и другим растворенным веществам, широко распространены среди бактерий, плесневых грибов, дрожжей, водорослей и простейших, а также среди вирусов, специфичных для некоторых из этих организмов.
Это древнейшие обитатели нашей планеты. Их можно увидеть в виде красноватого налета на консервированной продукции с большим количеством соли. Умеренные галофилы предпочитают 3–5% соли в воде, а экстремальные — 25% и более. Иногда ученые используют термин «экстремофилы» — микроорганизмы, живущие в сложных, буквально экстремальных условиях.
«Для размножения целевых генов, найденных в микроорганизмах, и выделения (секреции) соответствующих им белков в культуральную среду ученые используют дрожжи Komagataella phaffii,— рассказывает научный сотрудник ИЦиГ СО РАН Андрей Задорожный.— Методами генной инженерии они переносят нужные гены в геном дрожжей. С помощью мембранной фильтрации с поперечным течением и хроматографии высокого давления они получают искомые ферменты, а для идентификации продукта используют орбитальную ионную ловушку Orbitrap Fusion Lumos — один из новейших масс-спектрометров».
Штаммы проверяют на устойчивость к антибиотикам и разделяют на кластеры, в зависимости от их свойств и характеристик. Самый крупный кластер созданной базы ферментов (170 штаммов) составляют термофилы — микроорганизмы, которые живут и неплохо себя чувствуют в горячих источниках или в раскаленной почве, например, даже при тлении торфяных залежей или после самовозгораний больших скоплений бытовых отходов.
Термофильными считаются бактерии, существующие при температуре выше 45 градусов Цельсия. Ферменты, которые есть у термофилов, широко применяются для производства моющих средств и стиральных порошков. Некоторые кластеры названы по функциям бактерий, а некоторые — по условиям существования микроорганизмов, поэтому разные кластеры могут пересекаться. В частности, термофилы есть среди протеолитиков и целлюлозолитиков.
Термофилы, галофилы и психрофилы
Кластеры «целлюлозолитики» и «протеолитики», как следует из названия, используются для расщепления целлюлозы, например, при производстве глюкозы, а также для биодеградации трудноразлагаемых твердых бытовых бумажных отходов с получением на выходе природного газа. Протеолитические ферменты (протеаза) способствуют размягчению мяса и рыбы и широко используются в пищевой промышленности. Амилолитики (амилаза) действуют на полисахариды — превращают крахмал в сахар и применяются в хлебопечении, пивоварении и производстве спирта. Галофилы необходимы для деградации отходов фенола в сточных водах, а также для очистки почв от токсичных органических соединений, в частности, трихлорэтилена и хлорфенола, который образуется из препаратов, широко применяемых в сельском хозяйстве.
Ферменты нефтедеструкторов очищают окружающую среду от углеводородов, а ферменты психрофилов —холодоактивные ферменты, которые «работают» при температурах от минус 20 до плюс 10 градусов. Психрофилы формируют микрофлору регионов вечной мерзлоты. Большое количество психрофилов выделяют в мире из донных отложений Арктики и Антарктики, а российские биологи выделяют их из высокогорных пещер Сибири. Найдены психрофильные бактерии, обладающие мощным антимикробным действием, что, несомненно, представляет большую ценность для медицины, где одна из важнейших проблем — приобретение высокой устойчивости болезнетворных микробов к антибиотикам.
Сотрудники лаборатории у памятника Дмитрию Беляеву (он возглавлял ИЦиГ с 1959 по 1985 год). Рядом — одомашненная под его руководством лиса
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Сотрудники лаборатории у памятника Дмитрию Беляеву (он возглавлял ИЦиГ с 1959 по 1985 год). Рядом — одомашненная под его руководством лиса
Фото: Предоставлено ИЦиГ СО РАН
Полмиллиона геномных данных
Найденные штаммы не только подробно описаны — на их материале секвенированы (и собраны!) тысячи геномов, в которых идентифицировано более чем полмиллиона геномных и протеомных данных, выявлены сотни тысяч генных сетей и построено по 700 математических моделей на каждый геном. Полученная база — это интегрированная информация для создания новых штаммов и сообществ микроорганизмов: суперпродуцентов белков, ферментов, физиологически активных веществ, пробиотиков, антибиотиков, метаболитов для агроиндустрии, пищевой промышленности, медицины, утилизации бытовых и промышленных отходов, производства исходных компонентов для химической промышленности. Из свежих результатов — получен продуцент (штамм-производитель) аналога гемоглобина для добавления в растительное мясо.
В Институте цитологии и генетики СО РАН сегодня, по сути, создан производственный конвейер для создания штаммов-продуцентов «под ключ». В мире существует огромное разнообразие штаммов для промышленных целей. У разных лабораторий разработаны свои оригинальные и запатентованные продукты. Но сама технология производства ферментов известна и широко используется, хотя и имеет множество нюансов в каждом отдельном случае. Если кратко описать ее, то она выглядит следующим образом.
Весь процесс от а до я
Ученые выезжают в экспедицию и в природе (иногда у подножия вулкана или в ледяном горном озере, а иногда и на свалке) обнаруживают микроорганизм, из которого затем, уже в лаборатории, выделяют генетический материал — отрезки ДНК. Первая фаза проекта — это отбор интересующих микроорганизмов и дальнейшие генно-инженерные работы, второй этап — это уже масштабное производство ферментов в биореакторах — на данный момент их пока шесть штук емкостью по пять литров.
Полученный материал отбирают на предмет перспективности и идентифицируют в виде реального биологического объекта — последовательности нуклеотидов. Потом тиражируют ее в лабораторных условиях, чтобы встроить в геном другого организма, который будет не только синтезировать этот белок, но и секретировать — выделять наружу за пределы клетки в культуральную жидкость. Из нее получают готовый ферментативный препарат, а секретирующим организмом в ИЦиГе стали специальные дрожжи, растущие на обычном метаноле — дешевом техническом спирте. Чем больше количество клонированных копий в геноме дрожжей, тем выше производительность.
Разработанной в ИЦиГе технологией заинтересовались и коммерческие партнеры, например, компания «Эфко», которая входит в тройку крупнейших участников российского агропромышленного комплекса. Также эти работы вошли в государственные программы — миллиардный проект разработки и производства ферментов Курчатовского геномного центра. Курчатовский геномный центр — это консорциум организаций во главе с НИЦ «Курчатовский институт», исследования которого ориентированы на решение биотехнологических задач. Одна из таких задач — разработка информационно-компьютерной платформы для дизайна экспериментов по созданию штаммов суперпродуцентов с целевыми свойствами, а также цифровая паспортизация штаммов промышленных микроорганизмов. Федеральная научно-техническая программа финансирует приобретение для проекта нового оборудования, а также позволяет нанять новых сотрудников на каждый отдельный проект (в самые активные фазы работы при повышенной загрузке заказами в лаборатории работают до 50 сотрудников) и выполнять исследования по развитию генетических технологий.