На основании полученных данных о роли мезенхимных стромальных клеток в регуляции регенерации тканей и функций стволовых клеток, а также секретируемых этими клетками сигнальных биоактивных факторов в МГУ имени М. В. Ломоносова был разработан биологический препарат нового класса для лечения мужского бесплодия.
Фото: Getty Images
Фото: Фотобанк Лори
На все ткани мастер
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) — уникальные в нашем организме клетки. С одной стороны, они содержат популяцию стволовых клеток с мультипотентными свойствами, то есть имеющими сразу несколько потенциальных направлений дальнейшей их дифференцировки. Например, они могут превращаться в жировые клетки — адипоциты, или в клетки хряща — хондробласты, или в клетки кости — остеоциты. Так, при серьезных повреждениях кости теряется большой пул функционально важных клеток, поэтому экзогенное введение МСК может стать хорошим терапевтическим решением для восстановления костной ткани. Известно уже более ста клинических исследований на людях, подтверждающих эффективность и безопасность использования МСК при переломах и повреждениях кости и хряща.
С другой стороны, важнейшим свойством МСК является их способность управлять другими стволовыми клетками и клетками, поддерживающими их нишу (ближайшее микроокружение стволовых клеток) с помощью регуляторных биологических молекул, которые выделяются МСК и называются их секретомом. В состав секретома МСК входят такие вещества, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста фибробластов (FGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и сотни других. При этом действие факторов роста не ограничивается функцией, которая отражена в их названии. Мишеней у каждого фактора гораздо больше, просто названы они по тому действию, которое было открыто первым.
Схема моделирования нарушений сперматогенеза: крипторхизм и повреждение доксорубицином. При повреждении количество сперматозоидов и их подвижность снижается. Локальная инъекция препарата на основе секретома МСК под оболочку яичка приводит к восстановлению сперматогенеза и увеличению количества сперматозоидов
Еще одним важным компонентом секретома МСК являются цитокины, в том числе противовоспалительные: интерлейкин-10, трансформирующий фактор роста b1 и ряд других. За счет секреции данных факторов МСК показали свою эффективность для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний. В мире уже есть зарегистрированные лекарственные препараты, действие которых основано на эффектах секретируемых клетками биоактивных факторов, и они успешно применяются в клинике. Например, Alophizel — препарат для лечения болезни Крона (хронического воспаления кишечника). Или MultiStem, основными показаниями к применению которого являются колит, острый инфаркт миокарда и болезнь «трансплантат против хозяина».
Кроме того, среди продуктов секреции МСК определяют внеклеточные везикулы, которые представляют собой «пузырьки» с билипидной мембраной, в которой могут содержаться белки, кодирующие (мРНК) и некодирующие РНК (лучше всего изучены среди них микроРНК). Внеклеточные везикулы сливаются с мембраной других клеток или могут погружаться внутрь них за счет фагоцитоза. В итоге содержимое везикул попадает внутрь клеток и вносит вклад во внутриклеточную регуляцию. Например, было показано, что за счет микроРНК, входящих в состав внеклеточных везикул, происходит предотвращение дифференцировки фибробластов в миофибробласты, что может способствовать подавлению развития фиброза легких.
Таким образом, за счет своего многокомпонентного состава продукты секреции МСК имеют множество мишеней. А это делает МСК очень перспективным источником для лечения заболеваний, при которых повреждается не какой-нибудь отдельный ген или белок, а ткань или орган в целом.
Строение ниши сперматогониальной стволовой клетки. Сперматогониальные стволовые клетки (ССК) и клетки Сертоли располагаются в тандеме внутри семенного канальца. Клетки Лейдига находятся во внешнем пространстве между канальцами
Укол от мужского бесплодия
На основании данных о роли секретируемых МСК сигнальных биоактивных факторов, необходимых для стимуляции регенерации поврежденных тканей, в МГУ имени М. В. Ломоносова и был разработан препарат нового класса для лечения мужского бесплодия. На двух экспериментальных моделях было показано, что введение препарата на основе секретома МСК самцам крыс и мышей с бесплодием способствовало восстановлению структуры и функции ниши сперматогониальных стволовых клеток и, как следствие, процесса образования новых сперматозоидов — сперматогенеза.
В первой серии экспериментов для моделирования бесплодия крысам хирургическим путем поднимали яички в брюшную полость, тем самым моделируя патологическое состояние крипторхизма. Этот врожденный дефект — неопущение яичек в мошонку — является фатальным для сперматогониальных стволовых клеток и их микроокружения, поскольку в норме яички функционируют «снаружи» (в мошонке) при температуре 35оС, а в брюшной полости температура достигает 37оС.
В другой серии экспериментов по моделированию мужского бесплодия мышам вводили доксорубицин — препарат для лечения онкологических заболеваний. Он встраивается в ДНК быстро делящихся клеток, что приводит к остановке клеточного деления или клеточной гибели. Но быстро делящиеся клетки в организме бывают не только в опухолях. Стволовые клетки тоже активно делятся, чтобы восполнять пул клеток, которые активно используются организмом, например, сперматогониальные стволовые клетки. Доксорубицин действует и на клетки их ниши, что приводит к комплексному повреждению сперматогенеза.
Главными поддерживающими клетками ниши сперматогониальных стволовых клеток являются клетки Лейдига и клетки Сертоли. Клетки Лейдига располагаются снаружи семенных канальцев, и главная их функция заключается в синтезе тестостерона. Клетки Сертоли находятся внутри канальцев, и они «заключают в свои объятия» сперматогониальные стволовые клетки. Эти «объятия» чрезвычайно важны для поддержания способности этих стволовых клеток к пролиферации и дифференцировке на следующий этап. Кроме этого, клетки Сертоли выделяют ряд необходимых молекул, в том числе лактат, который важен для питания клеток сперматогенного дифферона.
При повреждении эта идиллия нарушается. Сперматогониальные стволовые клетки гибнут, количество клеток Сертоли снижается, а клетки Лейдига хуже секретируют тестостерон, что в конечном итоге приводит к нарушению структуры семенных канальцев и бесплодию. В нормальных канальцах много клеточных слоев, состоящих из сперматогониальных стволовых клеток и клеток их промежуточной дифференцировки. В поврежденных же канальцах сперматозоидов нет, других клеток мало, клетки расположены хаотично.
Но при введении под белочную оболочку яичка препарата на основе секретома МСК клетки Лейдига восстанавливают секрецию тестостерона, популяция клеток Сертоли растет, и таким образом поддерживается жизнедеятельность сперматогониальных стволовых клеток. В канальцах, которые восстанавливаются или уже восстановились после повреждения, можно увидеть сперматозоиды (показаны стрелками).
Результаты гистологического исследования у животных с моделируемыми нарушениями сперматогенеза
Токсических эффектов у лабораторных грызунов препарат на основе секретома МСК в месте введения не вызвал, не возникала и системная иммунная реакция. Оплодотворенные самки хорошо вынашивали здоровое потомство. Рожденное новое поколение грызунов, в свою очередь, также демонстрировало отличную репродуктивную функцию и способность давать здоровое потомство.
Таким образом, вся совокупность данных указывает на перспективность секретома МСК как лекарственного препарата для лечения мужского бесплодия. Теперь для применения секретома МСК в клинической практике необходимо доказать его безопасность и эффективность в клинических исследованиях на большом количестве пациентов.
Потенции регенерации
Каждый организм в разной степени обладает способностью к регенерации, то есть восстановлению структуры и функции поврежденных органов и тканей. Чем сложнее организм, тем эта способность проявляется хуже. Плоский червь планария может заново вырастить себе половину организма. Для человека примером успешной регенерации может быть заживление неглубокой раны на коже или повреждений слизистых оболочек.
Но несмотря на различия, механизмы регенерации у всех организмов во многом схожие. При повреждении новые клетки могут образовываться из уже имеющихся клеток путем их деления или из стволовых клеток путем дифференцировки (специализации). А стволовые клетки в зависимости от их типа могут обладать разной потентностью — количеством направлений, в которые может дифференцироваться стволовая клетка.
Например, зигота является тотипотентной, она способна давать начало всем клеткам организма и внезародышевых оболочек. Но и после рождения человека наряду с монопотентными клетками, судьба которых предопределена и развиваются они только в одном направлении, в нашем организме остаются мультипотентные стволовые клетки — они имеют сразу несколько направлений дифференцировки.
Но это не все. Будь стволовая клетка моно- или мультипотентной, для ее выживания и реализации заложенных в ней природой возможностей требуется нужное микроокружение, которое называют нишей стволовой клетки. В состав ниши входят поддерживающие клетки, которые выделяют регуляторные молекулы и необходимый матрикс для их правильного функционирования. Интересно, что помимо биохимической «сигнальной системы», для «общения» поддерживающих клеток со стволовыми может быть задействован другой вариант их взаимодействия — прямой «тактильный» межклеточный контакт.
Фармацевтические вызовы секретома
Может возникнуть логичный вопрос: если клетки оказывают свое терапевтическое действие за счет секретома, то зачем вводить сами клетки? Может, сразу вводить секретом? Однозначного ответа на этот вопрос пока нет. И в том и в другом случае есть свои фармакологические и биологические преимущества и недостатки.
Первая опасность может быть связана с развитием иммунного ответа на чужеродный введенный компонент, при этом на чужие клетки организм реагирует более агрессивно, чем на компоненты секретома клеток. Источником МСК может быть сам пациент, тогда это будет аутологичный препарат, либо другие доноры, в таком случае препарат будет аллогенным. Собственные клетки организм не атакует, аутологичное введение является более безопасным, однако более сложным и дорогостоящим процессом.
С технической точки зрения гораздо проще брать материал от доноров и получать единый препарат сразу для многих пациентов. Но с фармацевтической точки зрения донорский материал сложно стандартизировать, то есть разработать единые параметры оценки эффективности и качества препарата. МСК, выделенные от разных людей, различаются по своей способности пролиферировать и продуцировать разные факторы, в зависимости от возраста, пола, физиологического состояния организма, словом, всего, чем все мы друг от друга отличаемся.
Более того, МСК, полученные от одного человека, также могут отличаться друг от друга внутри своей популяции, что может определять их разный терапевтический вклад. Для того чтобы отобрать наиболее эффективные клетки из всей популяции, ученые стремятся найти дополнительные клеточные маркеры, которые присутствуют только на определенных МСК. Аналогичные проблемы вариабельности и необходимости стандартизации возникают при разработке продуктов на основе секретома МСК. Секретом МСК содержит сотни различных компонентов, содержание которых варьируется от донора к донору.
Еще одной нетривиальной задачей является определение подлинности секретома МСК. Измерить концентрации всего множества молекул, входящих в состав секретома МСК, очень сложно и дорого, приходится выбирать один или несколько ключевых факторов, которые, по данным исследований, вносят существенный вклад в реализацию терапевтического эффекта.
Одним из самых сложных моментов фармацевтической разработки таких биологических продуктов является показатель качества специфической активности. Суть данного показателя заключается в демонстрации биологического эффекта препарата в рутинном анализе качества. Другими словами, необходимо in vitro воспроизвести механизм действия МСК или продуктов их секреции. В зависимости от клинической задачи данный показатель будет меняться, что не позволяет сделать универсальную модель для препарата — надо разрабатывать подходящий тест для каждого продукта со своими показаниями.
Таким образом, разработка биологического препарата на основе МСК или секретома МСК требует не только применения классических протоколов разработки лекарственных препаратов, но и большой творческой работы с привлечением современных методов биомедицины. Выбор между использованием МСК или секретома МСК в каждом конкретном случае сделает разработчик на основании данных эффективности и безопасности исследуемого препарата.