Ишемия головного мозга, или недостаточность мозгового кровообращения,— одно из наиболее распространенных и неприятных сосудистых заболеваний головного мозга. Более 9 млн человек в мире страдают от таких болезней, и почти 12% людей от них умирают. Сосудистые заболевания мозга в этой страшной статистике уступают только заболеваниям сердца и онкологии.
Фото: david matos / unsplash.com
Фото: david matos / unsplash.com
Ишемия является одной из самых частых причин, ведущих к инсульту. Симптомы этой болезни не сразу проявляются, да и диагностировать ее не всегда удается. Над проблемой ранней диагностики ишемии работают и ученые. Однако долгое время моделирование подобных процессов было возможно исключительно на лабораторных животных. Но, к сожалению, не все полученные эффекты оказались применимы к человеку. Тогда ученые из Нейрокампуса РНИМУ занялись изучением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и созданием органоидов мозга, которые они выращивают прямо в пробирке. О том, как это происходит, каких результатов удалось достичь и как эта научная работа поможет в терапии ишемии, нам рассказала научный сотрудник лаборатории нейротехнологий Института фундаментальной неврологии Федерального центра мозга и нейротехнологий ФМБА России Вероника Усатова.
Моделирование процессов и заболеваний нервной системы
Направление, связанное с исследованиями индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и, в частности, с созданием органоидов мозга, возникло в Федеральном центре мозга и нейротехнологий три года назад, при формировании в структуре учреждения Института фундаментальной неврологии. В науке до появления технологии получения ИПСК моделирование процессов и заболеваний нервной системы человека было возможно только при использовании лабораторных животных, эффекты и закономерности, полученные на которых, часто не воспроизводились на человеке. Применение ИПСК человека позволило получать не только видоспецифичный материал, но и сохранять геномные особенности конкретных доноров. Если говорить об органоидах мозга, которые представляют собой трехмерные культуры, в которых развиваются специфичные для мозга типы клеток, то в сравнении с двумерными культурами в данных структурах достигаются приближенные к физиологически нормальным межклеточные взаимодействия и градиент растворимых факторов. Это позволяет изучать на данных объектах особенности развития человеческого мозга в норме и патологии, моделировать различные неврологические расстройства человека, изучать патогенетические механизмы и определять эффективность лечения пациентов.
«Поп-ит» для создания зачатка нервной системы
Формирование сфероидов и их последующая дифференцировка (превращение) в органоиды мозга может осуществляться учеными различными способами в зависимости от их целей. Я позволю себе остановиться на одном из возможных вариантов. Первым этапом спонтанной дифференцировки является получение эмбриоидных тел с целью формирования прототипа внутренней клеточной массы на стадии перед гаструляцией (как при естественном развитии эмбриона человека) с потенциалом развития клеток в три зародышевых листа — энтодерму, эктодерму и мезодерму. Для этого ИПСК помещают в специальные формочки из агарозы с большим количеством ячеек [похожи на поп-ит], в которых клетки оседают и не связываются со стенками формы, а образуют только межклеточные контакты. Чем больше клеток вы добавите и чем больше будет диаметр лунки, тем больше сферу вы получите. На всех стадиях роста для сфер создаются необходимые условия культивирования — они помещаются в инкубатор при температуре 37°C, поддерживается влажность 70% и уровень CO2 5%. Через несколько дней в составе среды происходит замена компонентов на те, которые инициируют образование нейроэктодермы (зачаток нервной системы). После происходит замена на среду для генерации нейральных прогениторных клеток (из которых могут образовываться как нейроны, так и астроциты). Завершающим этапом является стадия матурации (взросления), на которой состав среды подбирается таким образом, что замедляются процессы деления клеток, при этом нейроны в составе органоида приобретают различные функции и образуют между собой связи. На разных стадиях дифференцировки происходит оценка того, из каких клеток состоит органоид (методом иммуноцитохимии или проточной цитофлуорометрии) и функциональной зрелости нейронов (методом локальной фиксации потенциала действия).
Терапия при ишемии
Одним из направлений нашей команды в данной области исследований является выявление особенностей молекулярных механизмов ишемии и последующей реперфузии мозга в острой фазе. Общепринятым мнением является участие в патогенезе инсульта активных форм кислорода, которые при неконтролируемой генерации приводят к окислительному стрессу. Окислительный стресс в тканях мозга при инсульте неоднократно подтверждался, но косвенными методами, в режиме реального времени на нейральных клетках человека до этого никогда не исследовался напрямую. Понимание данных механизмов может выявить пути в терапии, направленной на коррекцию метаболических и сигнальных процессов при ишемии.
Визуализация метаболических процессов
В рамках нашего исследования мы получили органоиды мозга, в геном клеток которых встроили белковые флуоресцентные биосенсоры, чтобы визуализировать метаболические процессы. Данный подход позволяет через динамику флуоресцентного сигнала отражать динамику исследуемого параметра — например, изменение концентрации соединения, с которым взаимодействует сенсорная часть биосенсора. Таким образом, мы получили возможность в режиме реального времени наблюдать за изменениями уровня перекиси водорода, рН и соотношения НАД+/НАДН. Далее, моделируя ограничение кровотока в мозге, мы создаем условия глюкозно-кислородной депривации, то есть лишаем органоиды мозга кислорода и глюкозы в жидкостном и воздушном окружении. В моменты гипоксии и последующей реоксигенации с помощью флуоресцентной микроскопии в режиме реального времени мы наблюдаем за изменениями флуоресценции клеток в составе органоида мозга, чтобы выявить изменение уровня исследуемого нами метаболита или параметра. По последним данным наших экспериментов, мы не наблюдаем избыточной продукции перекиси водорода в процессе ишемии-реперфузии, что свидетельствует о том, что данный метаболит не является ключевым источником активных форм кислорода в острой фазе ишемии-реперфузии. Полученные данные сопоставимы с результатами, полученными нашими коллегами in vitro на первичных нейронах гиппокампа мыши и in vivo на мозге крысы, что может говорить о работоспособности данной модели и возможности использования ее для скрининга химических веществ в рамках изучения данной патологии.
Справка
Нейрокампус РНИМУ — это консорциум научных и медицинских организаций, флагманами которого являются РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Федеральный центр мозга и нейротехнологий ФМБА России, Институт биоорганической химии РАН и Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. В рамках консорциума будут развиваться новые медицинские нейротехнологии, которые серьезно повлияют на качество медицинской помощи в области неврологии и нейрореабилитации. В рамках исследовательских проектов под патронажем Нейрокампуса будет развиваться область синтетической нейробиологии и нейроинтерфейсов, что позволит создавать уникальные фармацевтические препараты и медицинские устройства для терапии заболеваний нервной системы и повышения эффективности нейрореабилитации.