Российский научный фонд выступил с инициативой об исследовательской биоэтике, и руководитель рабочей группы РНФ Наталия Шок подготовила серию экспертных интервью с ведущими российскими учеными: обсуждаются принципы работы с лабораторными животными. Сегодня — четвертое интервью серии. Собеседник Наталии Шок — Марина Зенкова, заведующая лабораторией биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, профессор, доктор биологических наук.
Заведующая лабораторией биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН Марина Зенкова
Фото: Из личного архива
Заведующая лабораторией биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН Марина Зенкова
Фото: Из личного архива
— Расскажите, пожалуйста, когда у вас появился первый контакт с лабораторными животными? Как так сложилось, что вы стали работать в биологии и с животными?
— Я работаю больше 40 лет в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ранее институт имел другое название — Институт биоорганической химии СО РАН, а еще раньше был отделом в Новосибирском институте органической химии СО РАН). Начнем с того, что мы в какой-то момент поняли, что молекулярной биологии не хватает для того, чтобы понять, что и как происходит.
Тематика нашей лаборатории — это создание препаратов, которые действуют на генетические программы, например опухолевых клеток. И мы долгое время работали на уровне клеток. Это тоже было непросто. Но примерно после 2003 года, как раз, когда я защитила докторскую диссертацию, у меня подросли очень хорошие ученики, и мы с ними решили, что нужно ставить эксперименты in vivo и переходить на более серьезные модели. Вот тогда мы начали сотрудничать с сотрудниками Института цитологии и генетики СО РАН Поповой Н. А., Калединым В. И и Николиным В. П., которые на тот момент, наверное, были лучшими в России специалистами в области именно экспериментальной онкологии. И они нас начали учить, просто учить, ставить нам руку: как правильно работать с животными.
В начале 2000-х это было еще не так сильно зарегулировано даже на европейском уровне, а вот уже в 2007–2008 годах пришло понимание, что важно создать биоэтический комитет в Сибирском отделении — стало необходимо указывать в любой научной статье, что протоколы исследований in vivo прошли экспертизу биоэтического комитета.
То есть как только вы публикуете результаты за границей, вы должны подтвердить, что все исследования проведены в соответствии с биоэтическими принципами. Причем в Европе эти нормы опубликованы, у нас — тоже, но мы в основном ссылаемся на европейские нормы биоэтических правил. Плюс мы ссылаемся на решения собственных биоэтических комитетов. Сейчас любой журнал, если вы начнете публиковать статью, вас спросит: «Были ли эксперименты на животных?» Если подобные эксперименты проводились, вы обязаны представить им номер решения биоэтического комитета о том, что эти эксперименты проводились в соответствии с необходимыми правилами. Вот такие формальности, но они приводят к тому, что мы можем сделать две вещи. Первая вещь: когда в биоэтический комитет приходит заявка, там есть несколько моментов, которые мы рассматриваем. Первое: будут ли причинены животным страдания? Все ли делается для того, чтобы не было издевательства над животными? Второе, что мы рассматриваем: насколько квалифицирован персонал, который проводит исследование?
— А как вы это оцениваете?
— Во-первых, у нас это чаще всего люди, которые уже имеют публикации в данной области. У них, допустим, есть аспирант, но он работает под руководством старшего научного сотрудника. Или есть заведующий лабораторией, имеющий опыт подобной работы. Это все указывается: что человек имеет опыт работы с животными порядка пяти лет или что он будет работать под руководством опытного человека. Или что работа будет проводиться в STF-виварии (англ. — specific pathogen free, «свободный от видоспецифических патогенов»; подробнее см. сайт Российского национального центра генетических ресурсов лабораторных животных на базе SPF-вивария Института цитологии и генетики ИЦиГ СО РАН), где он будет наблюдать, а манипуляции с животными будет проводить, допустим, опытный инженер. Все это в заявке указано.
Кроме того, важный момент заявки: исследователь должен указать, для чего этот эксперимент будет проводиться, какова цель, что он хочет получить из этого эксперимента. И мы как экспертная комиссия имеем возможность оценить, насколько поставленная цель может быть достигнута тем планом эксперимента, который представлен, насколько достоверные результаты будут получены, потому что указывается количество лабораторных животных в экспериментальной группе. И в случае каких бы то ни было несоответствий заявка с нашими комментариями, пожеланиями и вопросами возвращается заявителю. Он ее дорабатывает и снова представляет на рассмотрение.
И вот нам, я могу сказать честно, удавалось в нескольких случаях избежать излишнего повторения экспериментов, потому что мы в самом начале говорили: «Тут необходимо, допустим, увеличить число особей в экспериментальной группе животных, потому что только тогда вы получите достоверные результаты». Где-то, допустим, эксперты предлагали добавить еще экспериментальную группу. А где-то, наоборот, говорили, что эксперимент не нужен, и указывали, по каким причинам. В принципе получился такой консорциум. Мы работаем около десяти лет, и уже нет таких возвратов — люди научились формулировать и готовить пакет документов, а вначале такие случаи были нередки.
Еще интересный момент: один из членов биоэтического комитета — священнослужитель. Первое время это было так смешно, потому что он задавал вопросы, для ученого абсолютно наивные, типа: «А зачем вы это делаете?» Ну и когда он говорил что-нибудь вроде: «Вот, а зачем вы такие страдания животному причиняете?», я всегда комментировала так: «Я понимаю, что на людях всегда дешевле, потому что пройти через биоэтический комитет в любой клинике проще, чем пройти биоэтический комитет с экспериментами на лабораторных животных». Сейчас это уже не так, у медиков тоже стало сложно — мы с ними очень много работаем. Все совместные исследования с клиницистами проводим через этическую экспертизу — только у них называется не биоэтический комитет, а этический комитет, который регламентирует все клинические исследования.
И там мы пишем также очень подробную заявку, в которой расписываем, что мы хотим изучить, на каких когортах больных, как мы будем информировать больных, какие дополнительные процедуры это исследование потребует. Будут ли проводиться какие-либо манипуляции, приводящие к страданиям или к чему-нибудь прочему? Такого чаще всего в клинике нет, но все равно. И мы должны будем прикладывать каждый раз бланк информированного согласия, разработанный нами.
— Каковы особенности проведения исследований с участием лабораторных животных?
— При планировании экспериментов на животных кроме выполнения биоэтических норм необходимо четко формулировать цель эксперимента и определять, какими средствами эта цель может быть достигнута. В последние несколько лет, когда появились обширные базы данных, в которых депонированы первичные данные разнообразных исследований, выполненных на лабораторных животных, или результаты клинических исследований, мы начинаем с анализа того, что уже было получено. Такой подход сейчас очень популярен во всем мире. С развитием омиксных технологий появились такие сайты, содержащие базы данных по протеомным, геномным, скриптомным исследованиям. И вот сейчас, например, когда анализировали развитие меланомы у животных, мы взяли данные из нескольких баз — всего мы нашли шесть или семь полногеномных сиквенсов различных опухолей животных, выделенных in vivo. И в этих базах были приведены все данные геномного профилирования. Так как эти данные доступны, то нам достаточно их проанализировать и проводить подобный анализ лично.
— То есть вы имеете возможность не использовать животных?
— Не совсем так. Животных мы используем, но использование депонированных данных позволяет несколько сократить объем экспериментальной работы, которую мы должны сделать, и более направленно подойти к созданию дизайна эксперимента. То есть это работа, которую за вас кто-то сделал. Кому-то в этих данных понадобилось одно, кому-то — другое, а все (мировое научное сообщество) выигрывают.
— Получается, это такая форма научного обмена?
— Сегодня в науке накоплено очень много больших данных. Например, мы анализируем что-то с использованием омиксных технологий и вытаскиваем какой-то один параметр, который нас в данный конкретный момент интересует, а весь массив данных депонируем в соответствующую базу данных. И получается, что, когда какой-то другой исследователь начинает заниматься этими вещами, он может воспользоваться уже тем, что мы наработали, и получить результат, используя наш опыт. Это происходит примерно так: вы ссылаетесь на публикацию, и мы тоже ссылаемся, что данные были взяты для анализов из такой-то базы данных, они находятся в свободном доступе.
— Вы упомянули о том, что самостоятельно инициировали создание биоэтической комиссии.
— Это была не я. У нас параллельно несколько событий развивалось в Сибирском отделении РАН. В частности, создавался SPF-виварий, в котором содержатся животные без определенных патогенов. Мы, лаборатория биохимии нуклеиновых кислот, начали публиковать первые статьи, в которых были приведены результаты исследований in vivo. Одновременно значительно возросла потребность в экспериментах in vivo и у нас в институте, и в других институтах СО РАН. Ну и главное, нам стали рецензенты задавать вопросы о том, кто разрешил нам проведение экспериментов на животных, какой орган. Все это случилось почти одновременно, и назрела необходимость в создании вот такой биоэтической комиссии именно для того, чтобы регламентировать исследования.
— А где вы перенимали опыт?
— У нас есть Михаил Павлович Мошкин, он сейчас руководит SPF-виварием ФИЦ ИЦиГ (Федеральный исследовательский центр «Институт цитологии и генетики СО РАН»), известный физиолог. Всю жизнь он занимался физиологией животных. И сейчас он уже как руководитель SPF-вивария все эти исследования продолжает. Он и был инициатором создания комиссии, но быстро передал функции своим сотрудникам. На самом деле это большая работа. Например, я накоплю шесть-восемь заявок и целый день их потом читаю. Потому что мне нужно все прочитать, проанализировать, написать рецензию.
Понятно, что каждый день я так не делаю, не читаю, как только поступило: проще сравнивать сразу несколько заявок. Вопросы чаще всего бывают не то что общие, но иногда одни и те же мелочи проявляются. Должна сказать честно: время идет, и народ уже поднаторел в написании документов, понял, что от него требуется. Так как группа людей, которая работает с животными, не бесконечная. Эксперименты in vivo очень дорогие, я вам честно скажу, это самые дорогие эксперименты, и они очень длительные. Поэтому мы стараемся их ставить максимально заранее, со всех сторон себе соломки подстелить, все продумать, чтобы не потерять времени, получить нужные данные и выполнить условия эксперимента.
— Марина Аркадьевна, еще такой вопрос: есть ли у вас какое-то мнение по поводу работы этических комитетов в России? Может быть, есть какое-то сравнение с опытом — наверняка у вас были эксперименты в европейских странах?
— Вы знаете, когда я работала во Франции, я еще не работала с животными. Я вам честно могу сказать: проблема состоит в том, что там работа с лабораторными животными излишне зарегулирована. Наши коллеги из Англии говорят: «Нам проще приехать к вам и сделать эксперимент, чем сделать его в Англии». Это такое безумие, что им проще все сделать на человеке! Правда проще, чем получить разрешение провести эксперимент с участием животных. Плюс еще есть такая проблема, с которой сталкиваются очень многие европейцы: это безумно дорого. Мало у кого есть собственные виварии. Вот у нас собственный виварий, нам институт сделал такой подарок. Почему мы в собственном виварии? Не потому, что мы в SPF-виварии не хотели бы работать. Для сингенных опухолевых моделей SPF-животные не подходят, потому что нам нужно, чтобы иммунная система работала у животного, чтобы оно отвечало на стимулы иммунитета, а у животных, которые содержатся в SPF-виварии, этого нет. У нас есть эксперименты, которые мы делаем на мышах линии SCID (англ. — Severe Combined Immunodeficiency, тяжелый комбинированный иммунодефицит). Это бестимусные мыши, а есть эксперименты, которые мы должны сделать на мышах, у которых нормальная иммунная система. Например, по созданию всяких противоопухолевых вакцин. Тут нам уже нужны условия, в которых у нас мыши будут не SPF. Это проблема, поскольку сейчас проще купить дорогую SPF-мышь — их многие разводят.
— Скажите, стоит ли обучать молодых ученых исследовательской этике? Культуре эксперимента? Как это происходит?
— Вы понимаете, я не знаю, как в других институтах дело обстоит: я вообще работала только со студентами Новосибирского государственного университета, выполняющими бакалаврскую или магистерскую дипломные работы. Им мы «руку ставим» в лаборатории. Все эти слова о том, что надо-надо, остаются словами, пока человеку не дают бумажку и не говорят: «План твоего эксперимента мы обсудили, заполняй форму, покажи, как ты ее заполнил». Потом все ошибочки ты ему укажешь, а когда он начинает работать, ему показывают, как мышку держать, как правильно наркоз давать, как масочку на мышку надевать, как она в камеру помещается. Его учит для этого его научный руководитель или более опытный сотрудник. Есть очень талантливые люди, которые быстро обучаются работе с лабораторными животными и потом всю жизнь работают почти с закрытыми глазами. У них и мыши спокойные, не дергаются, никаких проблем. А есть люди, которым в виварий вообще запрещено ходить.
У нас есть лаборантка, которую мы не пускаем в виварий. Как только она заходит, у мышей шерсть дыбом встает, причем это человек, который проработал 30 лет в лаборатории. Но вот с животными ей категорически работать нельзя. Есть люди, которые очень боятся и узнают об этом только тогда, когда первый раз в виварий попадают. Таких мы тоже не пускаем в виварий, потому что ничего хорошего не получится.
— Скажите, пожалуйста, есть такое расхожее мнение, что нет большого доверия качеству экспериментов с участием животных в российских вивариях. Их якобы (данные) больше проверяют и тщательнее рецензируют.
— Опять же есть виварии и «виварии». Результатам Пущинского вивария и SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН доверяют. Потому что в эти виварии приезжали из американского центра по генетическим ресурсам, проверили все. И там работают очень грамотные люди, которых знает мировое научное сообщество. А если у вас полкомнаты где-то отгорожено, и там что попало творится… Например, когда мы захотели работать с мышами линии SCID и поняли, что для проведения коротких экспериментов нам неудобно работать в SPF-виварии, потому что у нас не все препараты можно подвергнуть стерилизации, как требуют условия SPF-вивария.
Мы купили свой изолирующий стерильный шкаф, где у нас живут эти мыши во время проведения эксперимента. Благодаря этому ни одно животное ни разу не умерло и ни одной инфекции не было. Шкаф стоит в отдельной комнате в виварии, и в течение коротких экспериментов эти иммунодефицитные мыши живут там, после эксперимента они подвергаются эвтаназии, и все. Мы пошли на затраты, чтобы у нас были стерильные условия. Доступ туда имеют только те сотрудники, которые проводят эксперимент.
— Как вам кажется, эти 3R-принципы (англ. — Replacement, Refinement, Reduction: replacement — замена лабораторных животных в эксперименте на альтернативные модели; refinement — усовершенствование методики эксперимента, обезболивание, обеспечение благополучия животных; reduction — уменьшение числа животных) могут привести к исчезновению практики экспериментов с участием животных?
— Без экспериментов с участием лабораторных животных вы ничего не сделаете in vivo. Потому что, допустим, любые 3D-технологии по клеточным вещам — это все равно модель, после которой нужно смотреть, что происходит in vivo. Вот поверьте мне, у нас есть такое направление исследований: мы смотрим доставку нуклеиновых кислот в опухоль, индуцированную у мышей. Все, что мы получали на 2D- и 3D-моделях in vitro, получилось совершенно по-другому при переходе к той же опухолевой модели, но in vivo. То есть как только заработали печень, почки, как заработали системы природного естественного выведения, все данные «поехали».
Другими словами, композиции, которые показывали суперрезультат in vitro, оказались совсем не супер и не работали in vivo. И сейчас мы любой скрининг любой системы для доставки лекарств начинаем с изучения биораспределения in vivo. При этом у нас есть системы прижизненного наблюдения за распределением препарата в животном, что позволяет расходовать в эксперименте меньше животных, так как после эксперимента животное живо, с ним ничего не произошло. Это особенно важно при проведении длительных экспериментов, так как позволяет существенно уменьшить число животных в группе, так как в ходе проведения эксперимента мыши не выводятся для проведения анализа.
— Правильно ли я вас поняла, что все-таки эта идея о полной замене животных на иные модели не вполне оправдана?
— Безусловно, какие-то вещи так можно посмотреть. Вот поверьте мне: мышь стоит 250 руб., а десять мышей — это 2,5 тыс. Вы можете провести на них эксперимент и получить много информации. А на 3D-скаффолде, в котором нужно заплатить за пластик, за стерильный бокс, за культуральную среду, сыворотку, антибиотики, там уже набегают такие круглые суммы. Там вы уже должны не десять мышей взять, на которых статистика хорошо набирается, потому что вы смотрите и кровь, и печень, и почки: сначала смотрите прижизненно, а потом — что происходит после эвтаназии. Вы смотрите много параметров. На 3D-скаффолде вы посмотрите только один параметр: проникает ли, допустим, в центр 3D-модели, который моделирует опухолевую мышь, к примеру, или очаг воспаления (там это еще более сложно). И больше вы ничего не получите: ни данных о нефротоксичности, о гепатотоксичности, ни данных о поведении вообще. Вы не получите данных о фармакодинамике или о фармакокинетике этих соединений. Вы не увидите, что у вас 99,99% вашего препарата мышка выделила с мочой ровно через 20 минут после того, как вы ей внутривенно его ввели. Вот такие вот мелочи!
И даже если это будет суперсистема в плане эффективности на клеточном уровне, она может быть неэффективной на уровне организма в силу разных причин. А ведь мы же делаем выводы, которые могут идти потом на создание производств, новых лекарств и всего прочего. С моей точки зрения, к любому эксперименту in vivo нужно подходить очень четко и формулировать для себя: что я хочу получить? Что я хочу увидеть в этом эксперименте? Насколько достоверные результаты позволят получить мои методы? И достаточно ли я обставляюсь контролями, чтобы те результаты, которые я получу, я мог бы однозначно интерпретировать?
— У меня заключительный вопрос, все же хотелось бы его к этике привязать. Как вы считаете, какая главная мысль для понимания этики экспериментов с участием лабораторных животных в российских реалиях?
— С моей точки зрения, если ты можешь сделать что-то, не используя животных, и получить адекватный результат — сделай это! Если ты не можешь этого сделать, не используя животных, ты должен продумывать не просто каждый шаг, а каждое минимальное движение. И продумать эксперимент таким образом, чтобы, даже сделав его и задействовав какое-то количество животных, ты получил знания, качественный результат. Необходимо детальное продумывание, адекватная оценка того соотношения, которое называется «цена—качество», «риск—польза». Насколько те данные, которые ты получишь in vivo, будут нужными, адекватными и, самое главное, достоверными? Основная проблема — это достоверность результатов.
— Безусловно — воспроизводимость и достоверность!
— Да. Потому что когда мне говорят: «Вот мы сделали большой эксперимент, у нас было 15 экспериментальных групп, в каждой из которых было по три мыши», я говорю: «Ребята, вы получили недостоверные результаты!» «Но у нас же было по три?»—«Ну вот программа статистики ANOVA дает цифру 20 для получения достоверных результатов». Потому что могут быть не ответившие на лечение, могут быть ответившие не так, могут быть какие-то еще странные результаты. Человек должен осознанно подходить к любому виду эксперимента. На самом деле, эксперименты на мышах мне что показывают?
При проведении эксперимента на лабораторных животных мы имеем дело с особями одного возраста, одного пола, примерно одного веса, у них в анамнезе нет никаких заболеваний и они здоровы, за исключением нашего воздействия, которое может состоять в инфицировании вирусом, или индуцировании у животных опухолевого процесса, или воспаления. При этом, даже начиная эксперимент с одинаковыми животными, мы наблюдаем достаточно большой разброс данных, связанный с индивидуальными особенностями животного. Когда вы переходите к данным, полученным в клинических исследованиях на человеке, то ввиду большего спектра индивидуальных особенностей, наличия сопутствующих заболеваний, возрастных изменений в организме или изменений, связанных с условиями жизни, разброс результатов (численного значения определяемого параметра) может быть настолько значительным, что можно найти в лучшем случае только корреляции.
Другими словами, в отличие от экспериментов на лабораторных животных, вы не получите на человеке, если это не эксперимент, а наблюдение, ответ «да—нет». И конечно, эксперименты in vivo для этого абсолютно необходимы. То есть у меня нет ощущения, что мы можем когда-то отказаться от эксперимента in vivo и работать на модельной, виртуальной мыши, использовать только 3D-моделирование, компьютерные модели. Хотя кто его знает? Может быть, лет через 50 или 100…
— Наука идет так быстро!
—Тогда они должны сделать всю биохимию к этой виртуальной мыши, и тогда она будет стоить, как крыло от самолета, а может быть, и даже больше — как целый самолет.
—Чем больше наука развивается, тем дороже становится ее продукция...
— Да, да. Мы как-то раз попробовали оценить, сколько стоит одна статья в Nature. Мы прикинули, что это порядка 10 млн в долларах. Если посчитать то оборудование, которое задействовано, количество авторов и количество экспериментальных дорогостоящих подходов, которые использованы в статье… Создается впечатление (это мое личное мнение), что в последнее время Nature как раз поддерживает публикации, в которых вот эта инфраструктурная составляющая очень мощная. То есть в работах используются несколько дорогостоящих технологий — например, какие-нибудь сложные технологии с использованием конфокальной микроскопии, секвенирование одной клетки (single cell sequencing or analysis), когда анализ проводится для одной клетки и сравнивается индивидуальное поведение каждой отдельно взятой клетки. Дополнительно используются сложные генно-инженерные подходы в комбинации с прижизненным наблюдением (real-time monitoring) за процессами, происходящими в клетках, сложные многоцветные флуоресцентные подходы, когда клетки (компартменты клеток) «покрашены» в разные цвета в зависимости от анализируемого процесса и вся клетка — она вся сияет. Я просто представляю, сколько каждый этот шаг стоит.
— Как вы видите возможные направления развития биоэтики? Потому что, может быть, это некие обучающие мероприятия? Или, может быть, какой-то обмен опытом?
— С моей точки зрения, неплохо было бы провести обмен опытом работы биоэтических комитетов, принадлежащих разным организациям, однако для этого нет необходимости собирать биоэтические комитеты в полном составе. Достаточно, допустим, чтобы от нашего биоэтического комитета результатами и опытом работы поделились председатель биоэтического комитета и его секретарь. Или провести онлайн-совещание. За этот год мы все научились пользоваться платформой Zoom, другими онлайн-платформами, поэтому такой обмен опытом можно провести для экономии времени и средств и в онлайн-формате.