ДНК-полимеразы отвечают за синтез ДНК — вещества наследственности. Именно в ДНК хранятся «инструкции», управляющие биохимическими реакциями в клетке: в нуклеотидной последовательности закодирована информация о структуре транспортных и рибосомальных РНК и всех белков.
Фото: Reuters
Фото: Reuters
При делении клеток ДНК-полимеразы удваивают ДНК в ходе репликации. Двухцепочечная ДНК расплетается, и задача ДНК-полимеразы — выбрать и включить правильный (комплементарный) нуклеотид, не совершив ошибки, которая приведет к мутации. Для синтеза всем ДНК-полимеразам обязательно нужен праймер, который синтезирует праймаза. Точность репликации очень высока: в среднем одна ошибка случается на миллиард нуклеотидов. У человека известно 16 ДНК-полимераз, но в репликации геномной ДНК задействованы всего три: Pol delta, Pol epsilon и Pol alpha в комплексе с праймазой.
Для чего нужны остальные ДНК-полимеразы
Большинство ДНК-полимераз защищают клетки от повреждений ДНК. Каждый день в клетке образуются десятки тысяч повреждений. Они могут быть вызваны окислительным стрессом, радиацией, ультрафиолетовым излучением или химическими канцерогенами окружающей среды. Многие повреждения ДНК блокируют высокоточные репликативные ДНК-полимеразы — остановка репликации может вызвать хромосомные нарушения и гибель клетки.
Существует несколько уровней защиты от повреждений ДНК. Основным механизмом защиты является репарация. Большинство поврежденных оснований и нуклеотидов удаляются из ДНК, а бреши точно застраиваются специализированными ДНК-полимеразами. Если повреждения избежали репарации, запускается альтернативный механизм защиты — синтез через повреждения, или транслезионный синтез. Транслезионные ДНК-полимеразы нетребовательны к структуре ДНК и эффективно включают нуклеотиды напротив поврежденных участков.
Существуют и другие механизмы защиты. Испанские исследователи в 2013 году описали фермент PrimPol, который одновременно обладает ДНК-полимеразной и ДНК-праймазной активностями. PrimPol может запустить остановленную репликацию, начав синтез ДНК после поврежденного участка по новой (синтез ДНК-праймера).
Транслезионный синтез ДНК и канцерогенез
В отличие от репликативных ДНК-полимераз точность синтеза транслезионных и PrimPol невелика: они совершают ошибки каждые 100–1000 нуклеотидов. Защищая клетки от повреждений ДНК, эти ДНК-полимеразы становятся источником мутаций. Конечно, такой мутагенез может быть опасен. Слишком высокая активность транслезионных ДНК-полимераз повышает риск возникновения онкологических заболеваний.
Но и потеря функций транслезионных ДНК-полимераз связана с канцерогенезом. Например, Pol eta синтезирует ДНК на участках с повреждениями, вызванными ультрафиолетом. Мутации Pol eta вызывают наследуемый синдром варианта пигментной ксеродермы. У пациентов к 20–40 годам часто развиваются множественные опухоли кожи. Потому очень важна правильная «настройка» процесса транслезионного синтеза.
Транслезионные ДНК-полимеразы и иммунитет
Мутагенез не всегда вреден и может быть даже полезен. Некоторые транслезионные ДНК-полимеразы вносят мутации в гены иммуноглобулинов в B-лимфоцитах. Это позволяет увеличить разнообразие антител и важно для формирования иммунного ответа на инфекции.
Транслезионные ДНК-полимеразы — мишени для противоопухолевой терапии
Действие многих препаратов химиотерапии основано на блокировании деления опухолевых клеток. К ним относятся алкилирующие соединения, препараты платиновой группы и нуклеотидные аналоги. Транслезионные ДНК-полимеразы помогают опухолевым клеткам преодолеть блоки репликации, вызванные этими препаратами. В нескольких лабораториях в мире уже получены ингибиторы ДНК-полимераз на основе низкомолекулярных химических соединений и рибозимов.
***
В нашей лаборатории мы пытаемся понять биологическую роль отдельных ДНК-полимераз. Для этого мы получаем рекомбинантные очищенные ДНК-полимеразы человека, синтезируя и выделяя их из клеток микроорганизмов. Затем мы изучаем их свойства с помощью реакций синтеза ДНК in vitro. Мы можем узнать, какие повреждения они «проходят», как часто совершают ошибки. Недавно совместно с лабораторией белковой инженерии профессора Дмитрия Жаркова из Новосибирска мы инициировали исследования на культурах клеток человека. С помощью методики рCRISPR-Cas9 мы выключили гены нескольких ДНК-полимераз, чтобы понять их вклад в клеточный ответ на окислительный стресс, химические канцерогены и препараты химиотерапии.
В любой популяции всегда встречаются разные варианты одного и того же гена. Полиморфизмы ДНК-полимераз могут влиять на индивидуальные риски развития заболеваний. Недавно мы обнаружили, что редкий полиморфизм очень сильно снижает активность Pol iota. Поскольку Pol iota защищает от рака легких, вызванного канцерогенными веществами, в дальнейшем было бы интересно узнать, насколько часто этот вариант встречается у курящих пациентов.
Наконец, недавно мы получили ДНК-аптамеры к Pol eta и PrimPol, эффективно связывающие эти ферменты и ингибирующие их активность. ДНК-аптамеры могут быть использованы вместо антител для анализа уровня экспрессии ДНК-полимераз в биологических образцах и потенциально в качестве ингибиторов.
Понимание механизмов транслезионного синтеза ДНК позволит лучше понять механизмы канцерогенеза и химиорезистентности и, возможно, продвинуться на один шаг вперед в лечении онкологических заболеваний.